Cas9核酸内切酶 Cas9 Nuclease CRISPR/Cas9基因编辑

Cas9 Nuclease

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Cas9 Nuclease来源于野生型酿脓链球菌S. pyogenes，是依赖RNA介导的内切核酸酶，可以特异地切割双链DNA（在DNA PAM存在的情况下，也可以切割单链DNA或单链RNA）。Cas9切割位点位于目标序列（target sequence）内，离PAM（NGG）区3个碱基。本产品经过密码子优化及核定位信号（NLS）设计，由大肠杆菌重组表达而来，编辑效率高，可用于细胞（造血干细胞、T细胞等）的基因修饰，也可用于分子诊断，检测病原体等。

产品特色

浓度：10-12 mg/mL；
纯度：≥ 95 % ；
内切酶、外切酶、RNase、磷酸酶阴性；
E. coli宿主DNA残留< 3 ng/mL
E. coli宿主蛋白质残留< 0.1 ppm
细菌内毒素< 10 EU/mg
支原体检测：阴性

应用案例

A：体外切割测试：3批次体外切割活性均达98%以上。

B：体内基因敲除，敲除效率与进口品牌一致。

图1. Cas9 Nuclease体外切割活性及基因敲除效率结果

存储条件

-25~-15℃储存，有效期1年。

FAQ

Q：CRISPR/Cas9的工作原理？

A：在CRISPR/Cas9 系统中，Cas9 核酸酶在sgRNA(singe guide RNA)的指导下直接对含有PAM（NGG ）的DNA 双链上游3 bp 处进行靶向切割，形成特定位置的DNA 双链断裂(DSB)，通过细胞固有的修复机制，如非同源末端连接修复（NHEJ）实现随机插入或删除碱基或者同源重组修复（HDR）来修复切口位点。

Q：CRIPSR Cas9/sgRNA RNP体系相比于质粒载体表达Cas9和Cas9稳定表达细胞株或慢病毒系统有什么优势？

A：1) Cas9蛋白直接作用靶基因，脱靶效率低、无DNA整合风险和启动子兼容性问题，大大提高应用安全性。2) 即用型体系，操作简便，显著缩短实验周期。3) 不需要自行构建载体或包装慢病毒，不需要病毒级的实验室环境。4) 在大部分细胞中，比质粒表达载体具有更高的基因编辑效率。

Q：翌圣Cas9 活性检测的方式有哪些？

A：活性检测分为细胞外切割活性检测和细胞内基因敲除效率检测两种。体外切割活性检测是通过检测两个被切割形成的片段的质量总量占比去评估Cas9 的切割活性，该检项是我们的QC放行项；细胞内基因敲除效率我们在293T 细胞、Jurkat 细胞以及T 细胞中进行了验证，但不是每批产品都验证。

Q：Cas9 的基因敲除效率能达到多少？

A：我们不能保证敲除效率一定能达到多少，敲除效率和细胞类型、位点序列、Cas9 与sgRNA 的摩尔比例、Cas9 与sgRNA 的浓度、电转仪类型、电转参数等因素都有关系。

Q：翌圣Cas9商业化生产是否涉及专利问题？

A：翌圣的Cas9是野生型spCas9，只是在E.coli中进行了重组表达。我们并未使用其它研究人员改造后的的序列去做商业化生产。一般CRISPR/Cas9的专利指的是该技术方法的专利，CGT公司利用该技术改造细胞，在产品上市前(临床阶段不需要付费)需要支付给专利持有者专利费，而Cas9 作为该技术会使用到的工具酶，并且是野生的，不存在专利问题。

Q：对于从事诸如干细胞、原代细胞或悬浮细胞，应该选择哪一种CRIPSR-Cas9体系？

A：干细胞、原代细胞或悬浮细胞等难转染细胞，转染试剂一般很难达到理想的转染效果，电转方式更适合这类细胞的转染，对于上述难转染的细胞推荐用Cas9/sgRNA RNP体系，根据具体实验情况摸索电转条件。

Q：Cas9 的推荐使用量？

A：Cas9 的使用量和客户的电转体系大小，电转仪类型，电转条件，细胞类型，sgRNA 靶向位点等有关，比如2×10⁵~1×10⁶ 个细胞可以尝试1-4 μM (25 μL电转体系)做用量的梯度摸索。

Q：Cas9 核酸酶，10mg/mL换算成摩尔浓度是多少？

A：Cas9 蛋白分子量为163kD，10mg/mL换算成摩尔浓度是61.35 μM 。

Q：如果使用Cas9 想要稀释，可以用什么稀释？

A：我们的Cas9 浓度是10 mg/mL 的，不建议稀释使用。

Q：如何快速确定sgRNA的有效性？

A：Cas9 剪切效率与sgRNA识别的靶序列有关，不同的sgRNA的识别效率不同。推荐选用已报道的位点或通过体外酶切实验，在体外酶切靶DNA片段，快速筛选有效的sgRNA，获得高编辑效率的sgRNA再进行后续的实验。

Q：使用 CRIPSR Cas9/sgRNA RNP体系进行细胞基因编辑，如何确定转染试剂的细胞转染效率？

A：高转染效率是获得高效基因编辑效率的必要条件，可通过转染NLS-Cas9-EGFP Nuclease (11364ES)或其它示踪蛋白来确定细胞的转染效率。对于转染试剂难以达到理想转染效果的细胞，推荐使用电转、显微注射等方式。

Q：使用14701ES时候，如何设计sgRNA？

A：本产品来源于野生型酿脓链球菌S.pyogenes。sgRNA骨架可使用

5’-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGUUUUAGAGCUAUGCUGAAAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUG -3’

"N"代表与DNA靶标序列特异性结合的20个核苷酸序列。

推荐购买翌圣货号11355ES的sgRNA合成试剂盒，产量高。只需根据目标区域设计，纯化后的sgRNA产物可搭配14701使用。

COA

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