在上期的“基因编辑探秘系列之原理篇”中，小翌已经详细介绍了CRISPR系统的分类、机制和原理。本篇文章将为大家介绍CRISPR技术的生物形式和递送技术。

CRISPR技术的生物形式

为了实现基因组编辑，CRISPR/Cas系统的组件需要进入靶细胞的细胞核中发挥作用，可以通过递送不同形式的Cas和向导RNA（gRNA）来实现，包括质粒DNA（pDNA），mRNA或Cas核糖核蛋白（RNP）三种生物形式。

pDNA形式

pDNA通常被用作非病毒DNA传递的载体，其介导的CRISPR技术是将Cas9蛋白和gRNA的基因序列融入单个或多个pDNA载体之中。因pDNA具有易构建、操作简便以及成本效益高等优点，成为了备受瞩目的基因编辑方法。目前广泛应用的Cas9质粒包含两个表达盒，一个是密码子优化的Cas9，一个是嵌合的gRNA。与我们细胞内遗传信息的流动一致，含有CRISPR系统元件的pDNA需先进入细胞核，随后转录成相应的mRNA，最后被转移到细胞质中以启动后续的蛋白质合成过程。

mRNA形式

mRNA介导的CRISPR基因编辑技术，其核心在于将Cas9 mRNA与gRNA共同精准地递送至靶细胞。相较于传统的pDNA转染方式，mRNA的递送方式能够更为迅速地启动蛋白质表达过程。与pDNA的应用策略不同，基于mRNA的编辑策略要求同时递送Cas9 mRNA和gRNA这两种关键的组分。Cas9 mRNA的制备主要依赖于体外转录（IVT）技术，并经过加帽和加尾修饰，以确保其稳定性和翻译效率。gRNA作为另一重要组件，存在双链和单链两种形式。双链形式的gRNA由crRNA和tracrRNA共同构成，这两部分需要通过退火过程形成稳定的复合物。在实际应用中，可以通过化学合成的方式分别制备crRNA和tracrRNA，进而组装成完整的双链gRNA。而单链形式的gRNA则是将crRNA和tracrRNA巧妙地融合成一个单一的分子，无需退火过程。单链gRNA可以通IVT或化学合成的方式获得，两种方法各有利弊，可根据实验需求进行灵活选择。

IVT作为一种广泛应用的gRNA生产方法，因其成本效益高、产量大以及操作简便等优点，在实验室中得到了广泛的推广和应用。化学合成gRNA是利用高通量化学合成平台来完成的，通过在gRNA的5’和3’端各加入3个硫代和甲氧基修饰，不仅可以提高gRNA的稳定性，还能有效降低脱靶效应，从而提高基因编辑的精确性和安全性。

RNP形式

在CRISPR/Cas系统的应用中，直接递送Cas9蛋白与gRNA，从而绕过pDNA或mRNA在细胞内部的转录与翻译过程，无疑是实现高效基因编辑的优选方法。这种基于蛋白的递送方式同样依赖于两个核心成分：Cas9核酸酶与gRNA，首先将Cas9蛋白与gRNA结合，形成带有负电荷的Cas9/gRNA核糖核蛋白（Cas9 RNP）复合物，随后将Cas9 RNP作为单一组分进行递送。这种技术不仅简化了操作过程，更提高了基因编辑的效率和准确性。

图1. CRISPR-Cas9的三种生物形式^[1]

三种生物形式的差异

每种CRISPR系统的生物形式都有其独特的物理、化学、生理特性。

稳定性

Cas9 pDNA表现出最高的稳定性，相比之下，mRNA的稳定性较差，可通过对其核苷酸进行化学修饰提升mRNA的稳定性。Cas9 RNP由蛋白质和gRNA组成，其结构使得它容易受到蛋白酶和RNases的降解，因此是最不稳定的形式。

递送方式

当Cas9的pDNA进入细胞后，它需经过转录和翻译的过程，最终产生Cas9蛋白。而Cas9的mRNA则更为直接，仅需被传递至细胞质中，便可启动翻译过程生成Cas9蛋白。随后Cas9蛋白与gRNA组装为复合体发挥编辑作用。相较之下，RNP形式能够直接入核进行编辑，无需经历上述复杂的转录和翻译过程。因此，递送Cas9 RNP成为了细胞基因组编辑中最为直接且高效的策略，通常也被认为是最为理想的编辑方法。

脱靶风险

在基因组编辑应用中，CRISPR/Cas复合物仅在基因组修饰发生期间暂时需要，其在细胞中过度存在会增加脱靶事件的风险。Cas9 RNP和mRNA在细胞内的存在时间相对较短，有助于降低脱靶效应的潜在风险。而Cas9 pDNA能够介导更长时间的基因表达，可能会增加脱靶编辑事件发生的风险。

Cas蛋白尺寸

由于常用的Cas9, Cas12a和Cas13a大小接近4kb, 而用于递送基因编辑器到体内的AAV系统的包装上限约为4.7 kb，因此寻找更小的基因编辑系统对于其高效体内递送具有重要意义。目前不同的Cas系统均有小型Cas蛋白被开发，如Cas9系统中来自金黄色酿脓葡萄球菌中的SaCas9（1000多个氨基酸）；Cas12系统中的AaCas12b和BhCas12b（1100多个氨基酸）；Cas14(又称Cas12f1，500个氨基酸) 、Cas12j（又称CasΦ，700氨基酸）；Cas13系统中的Cas13bt（~800氨基酸），基因编辑已进入迷你时代。

CRISPR/Cas系统常见的三种应用模式pDNA、mRNA和RNP各有优缺点。从张锋、刘如谦的最新发文来看，未来RNP形式的蛋白递送或将成为继mRNA之后的下一个焦点。

表1.CRISPRs生物形式对比

生物形式	优点	局限性
pDNA形式	●易于构建 ●操作简单 ●成本低	●尺寸过大增加CRISPR系统递送和表达的难度 ●pDNA转录、翻译过程会降低编辑效率 ●Cas蛋白长时间存在于细胞中，会导致更高的脱靶效应 ●有随机整合的风险，对细胞基因组的影响不可预测
mRNA形式 (Cas mRNA+gRNA递送)	体内编辑首选 ●mRNA在细胞中的转换速度快，可降低脱靶率 ●能对剂量进行精确控制，限制蛋白质的持久性，有助于降低CRISPR系统的脱靶效应	●mRNA的稳定性相对较差 ●在载体的设计方面必须保护mRNA免受胞外核酸酶的降解
RNP形式 (Cas蛋白+gRNA递送)	体外编辑首选 ●编辑效率高，极大程度降低脱靶效应 ●可以解决某些蛋白质表达困难	●Cas蛋白注入血液后易被蛋白酶降解 ●RNP分子较大，可能限制其穿透细胞膜 ●需保证Cas蛋白的纯度和活性，不能用于体内

CRISPR系统的三种递送技术

CRISPR系统的生物形式各异，因此其递送方法也呈现出多样性。目前，CRISPR/Cas9系统的递送策略已发展出多种方法，主要分为三大类别：生物递送方法、化学递送方法以及物理递送方法。

在生物递送方法中，常利用腺相关病毒（AAV）载体、慢病毒载体等作为传递CRISPR/Cas9系统的媒介，这些载体具有生物相容性好、转染效率高等优点，被广泛应用于基因编辑领域。

化学递送方法则主要依赖脂质纳米颗粒（LNP）等纳米材料作为载体，它们能够高效地封装CRISPR/Cas9系统并将其递送至细胞内，同时具有较高的靶向性和生物安全性。

物理递送方法则包括电穿孔、显微注射等技术，这些方法通过物理手段将CRISPR/Cas9系统直接导入细胞内部，虽然操作复杂且对细胞损伤较大，但在某些特定应用场景下仍具有独特的优势。

图2. CRISPR技术不同的递送方式^[2]

病毒载体

在CRISPR-Cas9系统中，病毒载体扮演着至关重要的角色。其中，AAV、慢病毒以及杆状病毒载体都是常用的递送工具。值得一提的是，AAV已经成为体内基因治疗领域最广泛应用的递送载体，并成功获得批准，递送CRISPR组件至人体用于疾病治疗。

AAV之所以备受青睐，源于它能够轻易地跨越物种屏障感染细胞，同时其免疫原性极低，大大降低了引发炎症反应的风险。然而，任何事物都有其局限性，AAV载体的最大包装容量仅为4.7kb，这对于体积庞大的CRISPR/Cas9基因编辑系统来说，无疑是一个巨大的挑战。尤其是当Cas9蛋白携带效应蛋白时，更是需要采取特殊的修改措施，如使用体积较小的SaCas9或将递送系统分割为两个载体，才能实现在AAV载体中的有效加载。

慢病毒作为能感染分裂和非分裂细胞的逆转录病毒，也常用作递送载体。由于慢病毒的10kb负载能力，整个CRISPR/Cas9系统都可以加载到其中，但慢病毒随机整合入宿主基因组可能引发免疫反应，甚至致癌。

脂质纳米颗粒（LNP）

尽管病毒载体递送系统已将CRISPR技术应用于临床，但其疗效仍受限于多重因素，如患者免疫反应、载荷大小限制、重复给药难度及长期基因表达等问题。因此，科研人员正积极探索新的递送策略，其中LNP-mRNA等非病毒系统备受瞩目。

脂质载体是一种很有前景的CRISPR-Cas9系统递送载体，通常由四种脂类组成：阳离子型（或电离型）脂类、聚乙二醇脂类、辅助磷脂和胆固醇。LNP的核心技术在于其具有独特pH依赖性的阳离子化脂质。在递送阶段，这种脂质能够在中性pH环境下保持中性状态，与周围的成分和谐共处。然而，一旦进入酸性环境，如细胞内的内体，它便会迅速转变为阳离子状态。这种电荷状态的转变不仅能够诱导粒子解离，还能够破坏核内体膜，从而大大增强其从核内体逃逸的能力。这种机制不仅提高了递送效率，还有效地降低了全身毒性，使得LNP成为一种安全且高效的递送工具。

目前，已有多款基于LNP-RNA的疗法成功获得FDA的批准，这充分证明了LNP技术在实际应用中的可行性和有效性。

图3. LNP组成^[2]

新兴递送系统

尽管LNP在临床实践中已展现出作为基因编辑纳米颗粒递送系统的先进性，然而，众多其他类型的纳米载体同样具备潜力，可巧妙地设计以进入细胞内部。例如，聚合物纳米颗粒、蛋白质衣壳递送系统以及类病毒颗粒（VLP）等，均为这一领域的研究者提供了新的递送策略。

在本文中，我们向您介绍了CRISPR/Cas系统的三种生物形式及递送方法，这些基础知识铺垫了对CRISPR技术的理解，为我们了解其在广泛领域应用奠定了基础。请继续关注我们的系列文章，在接下来的文章中，我们将带您了解CRISPR/Cas技术在细胞基因治疗、农业等不同领域中的应用，更多精彩内容，不容错过，敬请期待！

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参考文献：

[1] Yi Lin, Ernst Wagner and Ulrich Lächelt, Non-viral delivery of the CRISPR/Cas system: DNA versus RNA versus RNP, Biomater. Sci., 2022, 10, 1166–1192

[2] Taha EA, Lee J, Hotta A. Delivery of CRISPR-Cas tools for in vivo genome editing therapy: Trends and challenges. J Control Release. 2022;342:345-361.

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