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CRISPR/Cas9是一种由RNA指导Cas核酸酶对靶向基因进行特定DNA修饰的技术，源于细菌和古细菌为应对噬菌体和外源质粒的攻击而演化来的一种获得性免疫防御机制。在现代生物技术研究中，此系统是通过人工优化的具有引导作用的sgRNA(Single Guide RNA)引导核酸酶Cas9蛋白在与sgRNA配对的靶位点处剪切双链DNA，从而引起DNA断裂。由于生物体内非同源末端修复机制或同源重组机制修复DNA，导致基因移码突变、替换或删除，致使基因功能丧失。
Hifair® Precision sgRNA Synthesis Kit采用T7 RNA聚合酶混合物高效转录spCas9 sgRNA。本试剂盒含有能被Cas9蛋白识别并起支架作用的特异性序列，该序列的一部分能与使用者设计的目标特异序列部分重叠。退火形成互补链后由DNA聚合酶进行填充。最终生成用于转录的dsDNA模板。本试剂盒利用其提供的试剂和使用者自己设计的特异性DNA序列，单管反应可在4小时内获得20-100μg具有功能的sgRNA。
产品组分
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编号 |
组分 |
产品编号/规格 |
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11355ES25 (25 T) |
11355ES50 (50 T) |
11355ES60 (100 T) |
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11355-A |
10×sgRNA Enzyme Mix |
50 μL |
100 μL |
200 μL |
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11355-B |
10×sgRNA Reaction Buffer |
50 μL |
100 μL |
200 μL |
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11355-C |
2×Canace Enzyme Mix |
312.5 μL |
625 μL |
1.25 mL |
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11355-D |
Scaffold Template |
31.25 μL |
62.5 μL |
125 μL |
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11355-E |
NTPs（25mM each） |
200 μL |
400 μL |
800 μL |
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11355-F |
Control sgRNA Oligo（10μM） |
10 μL |
20 μL |
40 μL |
运输储存方法
干冰运输。-20℃保存，有效期两年。
注意事项
1. 反应体系中须严格注意不要混入RNase。
2. 实验器材（如：枪头、产品管等）注意严格使用 RNase Free用品。
3. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
4. 本产品仅作科研用途！
合成原理
操作流程
1. 上游引物（Target-specific sgRNA oligo）设计
A. 引物的5’端：T7启动子序列加保护碱基（20nt：TTCTAATACGACTCACTATA）
B. 转录起始位点：添加0~2个G，添加G的个数由靶序列的5’端决定，T7启动子至少需要2个G才能有效转录。
（注：若特异靶序列已经存在2个G，则不需要额外添加，额外的G会降低剪切效率。）
C. 特异的sgRNA靶序列（20nt）：靶DNA序列PAM（NGG）的5’端20nt碱基序列。
D. 引物的3’端：Scaffold Template退火序列（14nt：GTTTTAGAGCTAGA）。
示例：
DNA模板：
上游引物（Target-specific sgRNA oligo）：
2. sgRNA合成
A.sgRNA模板扩增
①按下列体系配制反应体系：
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组分 |
体积（μL） |
终浓度 |
|
RNase free H2O |
Up to 25 |
- |
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Scaffold Template |
1.25 |
- |
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sgRNA Oligo（10μM） |
1.25 |
0.5μM |
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2×Canace Enzyme Mix |
12.5 |
1× |
注： 1. Scaffold Template已预先与下游引物混合。
2. 使用试剂、容器等无RNase污染。
②PCR反应程序：
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循环步骤 |
温度 |
时间 |
循环数 |
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变性 |
98℃ |
10s |
30 |
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延伸 |
68℃ |
10s |
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保持 |
4℃ |
∞ |
③电泳检测：
使用2%琼脂糖胶，取5μL PCR反应液电泳检测条带大小及亮度，用100bp DNA Ladder（货号：10507）标定，其大小为120bp左右单一条带。
B.体外转录sgRNA
①按下列体系室温配制反应体系：
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组分 |
体积（μL） |
终浓度 |
|
RNase free H2O |
Up to 20 |
- |
|
10×sgRNA Reaction Buffer |
2 |
1× |
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NTPs (25 mM each) |
8 |
10 mM each |
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sgRNA模板（上述A获得） |
5 |
- |
|
10×sgRNA Enzyme Mix |
2 |
1× |
注： 1. 低温配置可能引起DNA模板沉淀。
2. 使用试剂、容器等无RNase污染。
②反应程序：
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温度 |
时间 |
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37℃ |
4h |
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4℃ |
∞ |
注：反应于PCR仪中进行，热盖打开，防止长时间导致反应液蒸发。
③DNA模板消化：
反应完成后，每管加入2μL DNaseⅠ（RNase free），37℃孵育15min以去除模板DNA。
④转录产物纯化：
体外转录产物可选用 RNA Cleaner 磁珠进行纯化（货号：12602），也可以采用酚/氯仿纯化法（具体操作步骤可联系Yeasen索取），以去除蛋白、游离的核苷酸等。
HB200916
