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干货│基因编辑探秘系列之在体外诊断领域的应用

近年来，随着诊疗体系从传统的以医院为中心变为去中心化，检测场景从医院检测变成社区或家用检测，开发规模化、自动化、快速化的检测技术成为趋势。科学界发现CRISPR/Cas系统除在基因编辑领域的应用以外，在POCT检测工具开发方面同样具有独特的优势，将现有技术结合CRISPR/Cas系统，有望开发速度更快、灵敏度更高、成本更低、检测特异性更好、操作更便利的POCT检测工具。目前，基于不同的Cas蛋白，研究者们已经成功开发出多种创新的检测方法，为未来体外诊断技术的发展奠定了坚实的基础。

 

图1.不同Cas蛋白特点及应用[1]

 

 

基于Cas9的检测系统

 

Cas9属于II型系统，有两个内切酶功能域RuvC和HNH，在sgRNA的引导下，Cas9通过识别靶标DNA上的PAM序列，特异性地与靶标DNA结合，并切割靶标DNA，其原理如图2（A）所示。

 

 
 
 
 

通过将NASBA和CRISPR/Cas9技术结合，Pardee等人建立了NASBACC （NASBA-CRISPR Cleavage）技术，该技术实现了对寨卡病毒的检测。NASBACC技术原理（如图2（B））如下：通过NASBA技术，对靶标RNA进行逆转录和扩增，扩增得到的带有toehold开关触发序列的dsDNA。若dsDNA含有特异性PAM序列，将被CRISRP/Cas9切割成两段短序列，在T7 RNA聚合酶作用下无法转录出带有toehold开关触发的完整序列，因此无法使传感器H变色。若dsDNA不含有特异性PAM序列，在T7 RNA聚合酶作用下，获得带有toehold开关触发的完整序列，从而激发传感器H变色。该方法无需复杂的温度循环步骤、灵敏度高、特异性强，将病原体的有无转化为肉眼可见的颜色变化，检测结果更直观。

 

图2.Cas9及NASBACC作用原理图[2][3]

 

 

基于Cas12的检测系统

 

与Cas9不同，Cas12除了能以PAM依赖的方式识别和切割dsDNA，还能够不依赖PAM序列特异性识别并切割ssDNA（单链DNA)。此外，Cas12除靶标DNA切割活性外，在Cas12、sgRNA和靶标DNA形成三元复合物后，能激发其反式切割活性，将体系中任意ssDNA序列切碎。利用其反式切割活性，研究者们基于Cas12a和Cas12b构建了多种新型核酸诊断技术，大大提高了病原体或疾病诊断的灵敏度和准确性。

 

图3.不同Cas蛋白作用原理[4]

 

DETECTR (DNA endonuclease-targeted CRISPR trans reporter)技术

 
 
 
 

DETECTR是一种基于CRISPR/Cas12a和RPA（重组酶聚合酶扩增技术）的检测系统，用于快速、灵敏地检测特定DNA序列。DETECTR系统采用RPA对靶标DNA进行扩增富集，并通过设计特定的crRNA，使其能够精确识别目标DNA序列,一旦Cas12a识别到目标，其反式切割活性被激活，体系中荧光标记的ssDNA报告分子被切割，产生荧光信号，从而指示目标DNA的存在。

 

图3.DETECTR作用原理[5]

 

HOLMES（Hybridization-based Optical Label-free Multiplexed Efficient Sensing）技术

 
 
 
 

HOLMES技术与DETECTR检测系统的开发处于同一时期，都是基于CRISPR/Cas12a的检测系统。该技术通过PCR技术对靶序列进行预扩增，扩增产物与Cas12a-crRNA结合，激活Cas12a的反式切割活性，对ssDNA荧光探针进行切割，释放荧光基团，形成检测信号。

 

图4.HOLMES作用原理[6]

 

HOLMES V2技术

 
 
 
 

HOLMES V2则是HOLMES技术的升级版，它在保持原有技术优势的基础上，核酸扩增技术增加了LAMP/RT-LAMP技术，CRISPR/Cas12a系统升级至CRISPR/Cas12b，进一步提高了检测的灵敏度和准确性。HOLMES V2而且不仅能应用于DNA靶标，也能用于RNA靶标的检测，为疾病的早期诊断和治疗提供了有力工具。

 

图5.HOLMES V2作用原理[7]

 

 

基于Cas13的检测系统

 

Cas13属于VI型系统，具有靶向切割目标RNA的能力。Cas13含有两个高等真核生物和原核生物核苷酸(HEPN)结合域，Cas13仅凭单个crRNA的引导便可与靶标RNA进行碱基互补配对，并特异性地对靶标RNA进行顺式剪切。此外，与Cas12类似，Cas13也具有反式切割活性，在识别到特定的RNA序列后，将体系中任意ssDNA序列切碎，其原理见图6（A）。这一特性使得Cas13成为检测RNA的理想选择，特别是在病毒性疾病的快速诊断中显示出巨大的应用潜力。

 

 
 
 
 

通过将CRISPR/Cas13a和RPA技术结合，张锋团队建立了SHERLOCK技术。该系统首先用RPA或RT-RPA技术对靶基因进行扩增，再利用T7 RNA聚合酶将扩增产物转录为RNA分子，与Cas13a/crRNA特异结合形成复合物，激活Cas13a的反式切割活性，对体系中荧光标记的FQ-ssRNA探针进行切割，发出荧光，从而实现对靶标的检测（如图6（B））。

 

图6.Cas13a及SHERLOCK作用原理图[8]

 

 

基于Cas14的检测系统

 

Cas14属于V型系统，是一个非常紧凑的RNA引导核酸酶家族(400到700个aa)，其大小仅为Cas9和Cas12的一半。Cas14具备不依赖PAM切割和反式切割ssDNA能力，同时可在PAM的引导下切割dsDNA。与Cas12不同，Cas14对靶标与crRNA之间的核苷酸碱基错配的耐受性较低，导致可靶向范围窄，能够用于高精度的核酸检测，如单核苷酸多态性基因分型。

 

 
 
 
 

通过将CRISPR/Cas14和扩增技术结合，Doudna等建立了DETECTR/Cas14技术。该系统首先采用RPA或RT-RPA技术对靶基因进行扩增，且其中一条扩增引物采用磷硫酰化修饰（防止被T7核酸外切酶切割）。使用T7核酸外切酶对扩增富集生成的靶标dsDNA进行处理，T7核酸外切酶切割扩增产物其中一条链，扩增产物中带有磷硫酰化修饰的一条链被保留下来。当Cas14特异性识别靶标ssDNA时，其反式切割活性被激活，体系中荧光标记的ssDNA报告分子被切割，产生荧光信号，从而指示目标DNA的存在。

 

图7.Cas14及DETECTR-Cas14作用原理图[9]

 

CRISPR/Cas系统作为基因编辑和体外诊断技术的基石，不同的Cas蛋白在应用中展现出各自独特的功能和优势，这些特性使得各个Cas蛋白在体外诊断检测系统中展现出了巨大的潜力和广阔的应用前景。随着技术的不断进步和创新，CRISPR/Cas技术将在未来的医疗健康领域发挥更加重要的作用。

 

 

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产品定位

产品名称

产品货号

Cas系列

Cas9 Nuclease

14701ES

ArCas12a Nuclease

14702ES

AapCas12b Nuclease

14808ES

RT-LAMP系列

Hieff® Bst Plus DNA Polymerase (40 U/μL)

14402ES

Hifair® III Reverse Transcriptase

11111ES

RPA系列

Bsu DNA polymerase (Large fragment, 5 U/μL)

11078ES

T4 UvsX Recombinase (2 μg/μL)

11079ES

T4 UvsY protein (2 μg/μL)

11080ES

T4 gene 32 protein (gp 32) T4噬菌体基因32编码蛋白

11081ES

Creatine Kinase (2 μg/μL) 肌酸激酶

14502ES

Exonuclease III (100 U/μL)

14525ES

 

参考文献

[1] 孙雯君,黄行许,王鑫杰.基于CRISPR的快速灵敏便捷分子检测[J].生物工程学报, 2023, 39(1):14.

[2] Jiang, F, Doudna, J. A. (2017). CRISPR-Cas9 Structures and Mechanisms. Annual review of biophysics, 46, 505–529.

[3] Pardee K, Green AA, Takahashi MK, et al. Rapid, Low-Cost Detection of Zika Virus Using Programmable Biomolecular Components. Cell. 2016 May 19;165(5):1255-1266.

[4] Li L, Li S, Wang J. CRISPR-Cas12b-assisted nucleic acid detection platform[J].Cold Spring Harbor Laboratory, 2018(10).DOI:10.1101/362889.

[5] Chen JS, Ma E, Harrington LB, et al. CRISPR-Cas12a target binding unleashes indiscriminate single-stranded DNase activity [published correction appears in Science. 2021 Feb 19;371(6531):]. Science. 2018;360(6387):436-439. doi:10.1126/science.aar6245.

[6] Li S Y, Cheng Q X, Wang J M, et al. CRISPR-Cas12a-assisted nucleic acid detection[J]. Cell discovery, 2018, 4(1): 20.

[7] Li L, Li S, Wu N, et al. HOLMESv2: A CRISPR-Cas12b-Assisted Platform for Nucleic Acid Detection and DNA Methylation Quantitation. ACS Synth Biol. 2019;8(10):2228-2237. doi:10.1021/acssynbio.9b00209.

[8] Myhrvold C, Freije CA, Gootenberg JS, et al. Field-deployable viral diagnostics using CRISPR-Cas13. Science. 2018 Apr 27;360(6387):444-448.

[9] Harrington LB, Burstein D, Chen JS, et al. Programmed DNA destruction by miniature CRISPR-Cas14 enzymes. Science. 2018;362(6416):839-842. doi:10.1126/science.aav4294.

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