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选择HRP(辣根过氧化物酶)、碱性磷酸酶标记的二抗 |
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荧光WB可自行选择对应的荧光素标记二抗 |
A. HC(免疫组织化学)使用小鼠抗HCN1单克隆抗体 对小鼠小脑的免疫组化分析,固定: 室温下10% 福尔马林溶液处理12-24小时,一抗: 小鼠抗HCN1单克隆抗体,1:1000,室温下孵育1小时,二抗: HRP/DAB 检测系统:生物素偶联的山羊抗小鼠,链霉亲和素过氧化物酶,DAB 色原(棕色),室温下孵音30分钟,复染色:Maver氏苏木素(紫色/蓝色) 细胞核染色,250-500uL,室温下5分钟.
B.ICC(免疫细胞化学)使用小鼠抗Hsp70单克隆抗体对小鼠热休克的黑素瘤细胞的免疫细胞化学分析.固定:福尔马林,-抗: 小鼠抗Hsp70单克隆抗体,1:1000,室温下隔夜孵育,二抗: Biotin 山羊抗小鼠,图片来自: Dr, Ewa Malusecka,Maria Sklodowska-Curie Memorial Cancer Ceter and Inst. Of Oncology, Poland.
C.IHF(免疫组织荧光)使用小鼠抗Neuroligin 4单克隆抗体对小鼠齿状回的免疫组织荧光分析,固定:甲醛固定石蜡包埋-抗: 小鼠抗Neuroligin 4单克隆抗体,1:100.二抗: FITC 山羊抗小鼠(绿色).复染色: DAPI(蓝色) 细胞核染色,1:1000.图片来自: Rachel Reith, NIH/NIMH.
D.ICF(免疫细胞荧光)使用小鼠抗HO-1单克隆抗体对人HeLa Cels的免疫细胞荧光分析,固定:室温下2% 甲醛处理20分钟,一抗: 小鼠抗HO-1单克隆抗体,1:100,4℃下孵育12小时,二抗: FITC 山羊抗小鼠 (绿色),1:200,室温下孵育2小时,复染色: DAPI(蓝色) 细胞核染色,1:40000,室温下2小时,染色定位: 微粒体,内质网,低氧时定位至细胞核.放大倍数: 100x.
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通常用二抗是用免疫球Fc,Fab片段免疫制备如IgG( H&L)，这类抗体和lgG分子的重链和轻链都可以反应，实验中为避免重轻链干扰可选择只用Fc或者只用fab免疫的二抗，从而避开重链(大小约55KDa)轻链(大小约25KDa)干扰. |
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F(ab')2片段形式的二抗可避免与Protein A/G或与Fc受体的结合，其分子本身比较小，更容易渗透入细胞组织结构内而灵敏度更高。 |
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Fab片段形式的二抗是只含有一个结合位点，可用来封闭内源性的免疫球蛋白;它是最常用也是性价比最高的二抗形式，这类抗体和laG分子的重链和轻链都可以反应，也可以和其他的免疫球蛋白家族(IlqM，IgA，lgD,IgE)和亚家族反应，因为所有的免疫球蛋白都有相同的轻链. |
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