作为一个进实验室不久的实验小白，最近实验室师兄新购买了一步法定量试剂，而我一直使用的是“先反转录再定量”，那一步法定量试剂又是什么鬼？
为了跟上大师兄的脚步，不拖实验室后腿，我学习总结了以下材料。
实时定量PCR（Quantitative Real-Time PCR，即qRT-PCR或qPCR），是对基因和基因转录水平（即RNA）定量的重要方法。对于RNA的定量，需反转录（Reverse Transcription，即RT）和定量（qPCR）两个过程。
根据实验操作步骤的不同，可分为：One-step RT-qPCR、Two-step RT-qPCR。
One-step RT-qPCR
实验过程：RT与qPCR在同一个反应管中，可实现对RNA的直接定量。
实验方法优点：1、多样本基因定量：在市面上的预混液（如师兄买的小翌家的One-step RT-qPCR SYBR® Green Kit）基础上，配制含待测基因上下游引物的Mix，即可实现对不同待测样本同一基因的检测。2、污染几率低：较少的加样次数，有效降低体系配制过程中组分污染的几率；3、操作简便，节省时间。
考虑到RT和qPCR均是酶促反应，核心酶是Reverse Transcriptase和DNA Polymerase。而两个酶促反应在同一体系下进行，必然会牺牲其中之一的性能，因此该方法存在以下缺点：1、RT过程：①对模板RNA质量要求高：RNA质量的优劣严重影响逆转录效率；②模板使用量较大：一步法qRT-PCR使用基因特异性引物，而两步法qRT-PCR的RT过程使用Oligo dT和Random Primer最适比例混合液作为引物，就反转录产物量而言，基因特异性引物低于Oligo dT和Random Primer；③易造成引物二聚体的形成：在37-50℃条件下，上下游引物3’末端易发生退火，而Reverse Transcriptase最适酶活温度恰恰多为37-50℃。2、qPCR过程：①若为染料法定量，引物二聚体会干扰定量结果；②DNA聚合酶酶活受到逆转录体系中某些组分的抑制，影响扩增效率。
精明的科学家们通过对RT Enzymes和DNA Polymerase结构改造，优化酶反应离子环境，减少抑制成分，实现RT和qPCR反应均以足够大的效率在同一体系中进行。
Two-step RT-qPCR
图3.两步法RT-qPCR反应体系与过程
对于绝大多数同学来讲，是进入实验室学到的最基础最经典的实验技术。实验过程是：先RT，后qPCR，通过定量cDNA，对RNA间接定量。
实验方法优点：RT过程：1、RNA要求宽泛：大多数RT Enzymes可使用1ng-1μg起始模板量总RNA高效率逆转录（实验室常买的是小翌家的HifairTM RT Enzymes可兼容1pg-5μg起始模板量总RNA）;2、应用广泛：cDNA可用于文库构建或基因克隆等。qPCR过程：1、扩增效率高：RT过程产生的cDNA，可经5-20倍稀释，最大程度上减少对定量反应的抑制；2、高通量多基因定量：逆转录得到cDNA样品，可同时实现多个基因检测。
该方法将RT和qPCR两种酶促反应分开进行，更便于RT Enzymes和DNA Polymerase酶活性的释放。但分步操作会耗时较长、需多次加样移液，可能会增大产生误差和交叉污染的几率。
One-Step or Two-Step？
我统计了两种方法的特点及应用，以备后续实验时，更好的选择定量方法。
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One-step Real-Time-qPCR |
Two-step Real-Time-qPCR |
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RT反应的引物 |
Gene-specific primers |
Oligo(dT) primers Random hexamers Gene-specific A combination of the above |
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优势 |
1.高通量样本的基因定量 2.减少移液的次数，降低污染的几率 |
1.RNA、DNA均可作为模板定量 2.定量范围宽广，检测灵敏度高 3.高通量基因定量 4.分步进行，中间产物cDNA用途广泛 5.分步进行，可优化逆转录过程和扩增过程 |
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注意事项 |
1.模板RNA要求较高 2.引物要求高 3.珍稀样本不适合 |
1.防止多步操作带来的误差和污染 2.样本量多时，工作量大 |
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最佳选择 |
1.多样本的单个基因分析 |
1.对单个样本进行多个目标基因的扩增 2.需要重复利用cDNA进行更多的扩增 |
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