——《Nature》《Cell》《Science》作者的共同选择
荧光定量PCR是一类高灵敏的实验，要求实验人员操作高度精细化。因此，在进行qPCR实验过程中，我们总是不可避免的会遇到问题：
一、 非实验因素的相关问题
• 实验室qPCR实验项目多，仪器被占用，辛苦配制后的反应体系不知如何处置
• 定量样品多，加样任务繁重，眼花目眩担心加样错误，实验结果不可信
• 上机时间长，上机实验次数受限，实验任务不能按计划定期完成
• 实验室仪器更换新仪器，实验室定量仪器多，定量试剂与仪器不匹配
二、 受实验因素限制的问题
• 低丰度基因定量问题
• 复杂的引物设计与筛选过程、灵敏度、复孔重复性……
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翌圣生物作为研发qPCR试剂的资深厂家，匠心研发了一款高性能qPCR预混液——Hieff UNICON® Universal Blue qPCR SYBR Green Master Mix，可以一次性解决上述实验烦恼。其中Universal ROX替代了传统ROX，弥补不同仪器平台的光程差，实现了适合所有qPCR仪器。另外，产品采用抗体法修饰，同时配方添加了基因扩增的促进因子，产品的扩增性能大大提升，完美兼容了科研端老师对高性能的需求与工业端企业高效率的要求。
产品特点
全仪器平台通用：预混特定类型参比染料，无需调整ROX浓度
易于示踪：蓝色预混液，观察颜色可直接区分是否加样
强稳定性：室温配制体系，配制后的体系可4℃放置24 h，检测结果无变化
上机快速：兼容常规程序与快速程序，最快46 min完成定量实验
扩增性能好：扩增效率高，特异性好，可检测个位拷贝数基因
产品性能
1、 全平台通用：适用于所有qPCR机型
图1. Hieff UNICON® Universal Blue 预混液可实现全平台通用。
针对不同仪器平台，与T品牌对比，Hieff UNICON® Universal Blue 预混液Ct值起峰更加靠前。以2 µL的质粒10倍梯度稀释液为模板，扩增IL23R基因。
2、灵敏度高：可检测至单拷贝
图2. Hieff UNICON® Universal Blue 预混液可有效检测7个数量级范围的模板量，扩增效率高，可在宽广的线性范围内获得良好的线性关系。
以2 µL的106-100拷贝的质粒为模板，扩增人IL23R基因。
3、检出率和特异性良好：广泛适用于30-70%GC含量的扩增子
图3. Hieff UNICON® Universal Blue预混液广泛适用于30-70%GC含量的扩增子，保证了极高的特异性检出率。
以2 µL的293T cDNA为模板，利用Primer5软件设计1000对长度为200 bp扩增子（GC%含量30%-70%）的引物，随机扩增其中的27个扩增子。
4、分辨率高：可精准分辨2倍模板浓度差异
图4. Hieff UNICON® Universal Blue 预混液可精准区分2倍模板浓度差异。
以2 µL的293T cDNA原液的2倍梯度稀释液为模板，扩增GAPDH基因。
5、复孔重复性好：90个复孔
图5. Hieff UNICON® Universal Blue预混液具备良好的重复性，90个复孔的扩增曲线高度重合，Ct值标准偏差<0.2。
以1 µL的293T cDNA为模板，扩增GAPDH基因。
6、良好的稳定性：预混液反复冻融50次不影响扩增性能
图6. Hieff UNICON® Universal Blue预混液反复冻融50次，扩增性能无变化。
以1 µL的293T cDNA为模板，使用不同冻融次数的预混液，扩增C2orf68基因。
客户反馈
复旦大学附属妇产产科医院
样本来源：小鼠卵巢癌细胞系ID8,HM1
浙江大学
样本来源：小鼠附睾脂肪RNA
中科院植生所
样本来源：拟南芥叶片RNA
翌圣qPCR Mix部分发表高分文献
[1] Yu Q, Liu S, Yu L, et al. RNA demethylation increases the yield and biomass of rice and potato plants in field trials. Nat Biotechnol. 2021. (IF 54.908)
[2] Dong W, Zhu Y, Chang H, et al. An SHR-SCR module specifies legume cortical cell fate to enable nodulation. Nature. 2021. (IF 49.962)
[3] Bi X, Wang K, Yang L, et al. Tracing the genetic footprints of vertebrate landing in non-teleost ray-finned fishes. Cell. 2021. (IF 41.582)
[4] Liu S, Hua Y, Wang J, et al. RNA polymerase III is required for the repair of DNA double-strand breaks by homologous recombination. Cell. 2021. (IF 41.582)
[5] Lu XY, Shi XJ, Hu A, et al. Feeding induces cholesterol biosynthesis via the mTORC1-USP20-HMGCR axis. Nature. 2020.(IF 49.962)
[6] Liu CX, Li X, Nan F, et al. Structure and Degradation of Circular RNAs Regulate PKR Activation in Innate Immunity. Cell. 2019. (IF 41.582)
[7] Han X, Wang R, Zhou Y, et al. Mapping the Mouse Cell Atlas by Microwell-Seq. Cell. 2018（IF 41.582）
常见问题解析：
1. 引物设计技巧
1）引物最好应设计成跨越一个外显子-外显子连接，其中一条扩增引物可以潜在地跨越实际外显子-内含子边界。这种设计可以减少从污染的基因组DNA中扩增到假阳性的风险。
2）引物应具有特异性。引物设计完成以后，应对其进行BLAST检测。
3）引物长度一般在18~27 bp，不应过长否则导致其延伸温度过高，不适于Taq DNA 聚合酶反应。
4）引物GC含量在40%~60%，GC含量过高或过低都不利于反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。另外，上下游引物的Tm值是寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下，50%寡核苷酸双链解链的温度。有效启动温度，一般高于Tm值5~10℃。可按公式Tm= 4（G+C）+2（A+T）估算引物的Tm值，也可以通过软件如Primer Premier或者网页工具计算引物Tm值。
5）引物3′端不能选择A，引物3′端错配时，不同碱基引发效率存在着很大的差异，当末位的碱基为A时，即使在错配的情况下，也能有引发链的合成，而当末位链为T时，错配的引发效率大大降低，G、C错配的引发效率介于A、T之间，所以3′端最好选择T。
6）碱基要随机分布，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3′端不应超过3个连续的G或C，因这样会使引物在GC富集序列区错误引发。
7）引物自身及引物之间不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹结构使引物本身复性。这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。引物自身不能有连续4个碱基的互补。两引物之间也不应具有互补性，尤其应避免3′ 端的互补重叠以防止引物二聚体的形成。引物之间不能有连续4个碱基的互补。引物二聚体及发夹结构如果不可避免的话，应尽量使其DG值不要过高。
8）PCR产物的长度通常控制在80-300 bp,为了保证扩增效率，在设计引物时要考虑PCR产物的长度。
2. 异常结果分析
1）无Ct值出现
①采集荧光信号的步骤有误：在退火/延伸结束采集信号；
②引物降解：可通过PAGE电泳检测其完整性；
③模板量不足：对未知浓度的样品应从系列稀释样本的最高浓度做起；
④模板降解：避免样品制备中杂质的引入及反复冻融的情况。
2）Ct值出现过晚(Ct>35)
①扩增效率低：反应条件不够优化，引物设计存在问题，可试用三步法进行反应，也可适当降低退火温度等；
②PCR产物太长：一般采用80-150bp的产物长度。
3）标准曲线线性关系不佳
①加样存在误差：使得标准品不呈梯度；RNA模板推荐使用1×TE缓冲液进行梯度稀释，DNA模板推荐使用ddH2O稀释。
②标准品出现降解：应避免标准品反复冻融，或重新制备并稀释标准品；
③引物设计不佳：重新设计引物；
④模板中存在抑制物，或模板浓度过高。
4）NTC有扩增(Ct<32)
①引物设计不够优化：应避免引物二聚体和发夹结构的出现；
②引物浓度不佳：适当降低引物的浓度，并注意上下游引物的浓度配比；
③气溶胶污染：扩增产物泄露很容易在实验室中引发气溶胶污染，一旦污染，定量检测结果就会不准确。推荐使用DNA/RNA Remover 核酸气溶胶污染清除剂。
5）扩增效率低
①引物设计不够优化；
②反应条件不够优化：可适当降低退火温度或改为三步扩增法；
③反应体系中有PCR反应抑制物：一般是加入模板时所引入，应先把模板适度稀释，再加入反应体系中，减少抑制物的影响。
订购信息
| 产品定位 |
产品名称 |
产品货号 |
规格 |
高灵敏通用型定量预混液(染料法) |
11184ES03 |
1 mL |
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11184ES08 |
5×1 mL |
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11184ES50 |
10×5 mL |
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|
11184ES60 |
20×5 mL |
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