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COA
已发表文献
Hifair® Ⅲ One Step RT-qPCR Probe Kit是以RNA为模板进行定量PCR反应的试剂盒。在实验的过程中，逆转录和定量PCR在同一反应管中进行，简化了实验操作，降低了污染的风险。本试剂盒以RNA为模板，使用基因特异性引物，利用耐热Hifair® Ⅲ Reverse Transcriptase高效合成第一链cDNA，并搭配使用探针和UNICON® HotStart Taq DNA Polymerase，配合优化的缓冲体系能够特异灵敏的对RNA模板进行精确定量。
本试剂盒以预混的Mix形式提供，2×Hifair® Ⅲ P buffer包含优化的缓冲体系和dNTPs等，优化了有效抑制非特异性 PCR扩增的因子和提升PCR反应扩增效率的因子，适用于荧光标记探针的高特异性检测系统。此外，Hifair® UH Ⅲ Enzymes包含比例优化的Hifair® Ⅲ Reverse Transcriptase、RNase inhibitor及UNICON® HotStart Taq DNA Polymerase等。
产品组分
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组分编号 |
组分名称 |
产品编号/规格 |
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11145ES50 (50 T) |
11145ES70 (200 T) |
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11145-A |
2×Hifair® Ⅲ P buffer |
500 μL |
2×1 mL |
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11145-B |
Hifair® UH Ⅲ Enzymes |
50 μL |
200 μL |
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11145-C |
Hieff® 50×High Rox |
20 μL |
80 μL |
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11145-D |
Hieff® 50×Low Rox |
20 μL |
80 μL |
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11145-E |
RNase free ddH2O |
500 μL |
2×1 mL |
【注】P buffer 为Probe buffer 的简写，UH 为UNICON-Hifair 的简写。
适用机型
High Rox 适用机型：ABI 5700, 7000, 7300, 7700, 7900HT Fast, StepOne™, StepOne Plus™
Low Rox 适用机型：ABI 7500, 7500 Fast, ViiA™7, QuantStudio™ 3 and 5, QuantStudio™ 6,7,12k Flex
Stratagene MX3000P™, MX3005P™, MX4000P™
不需要 Rox 校正的仪器型号：
Bio-Rad CFX96™, CFX384™, iCycler iQ™, iQ™5, MyiQ™, MiniOpticon™, Opticon®, Opticon® 2, Chromo4™
Eppendorf Mastercycler® ep realplex, realplex 2 s; Qiagen Corbett Rotor-Gene® Q, Rotor-Gene® 3000, Rotor-Gene® 6000
Roche Applied Science LightCycler® 480, LightCycler® 2.0; Lightcycler® 96
Thermo Scientific PikoReal Cycler; Cepheid SmartCycler®; Illumina Eco qPCR
运输和保存方法
冰袋运输。-20℃避光保存，有效期1年。本品避免反复冻融。建议分装保存。
注意事项
1. 实验过程中请使用 RNase free 耗材。
2. 为了您的安全和健康，请穿实验服并佩戴一次性手套操作。
反应体系（以 20 μL为例）
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组分 |
加入量 |
终浓度 |
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2×Hifair® Ⅲ P buffer |
10 μL |
1× |
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Hifair® UH Ⅲ Enzymes |
1 μL |
- |
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Hieff® 50×High Rox or Low Rox |
0.4 μL |
- |
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Gene Specific Primer Forward (10 µM) |
0.4 μL |
0.2 μM |
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Gene Specific Primer Reverse (10 µM) |
0.4 μL |
0.2 μM |
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TaqMan Probe (10 µM) |
0.2 μL |
0.1 μM |
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模板 RNA |
Total RNA: 1 pg-1 µg |
- |
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RNase free ddH2O |
to 20 μL |
- |
【注】:
a 所有试剂使用前应充分混匀。
b 参比染料：Rox的添加，可根据不同仪器型号进行选择，具体可参考【适用机型】。
c 引物浓度：通常引物终浓度为0.2 μM，也可以根据情况在0.1-1.0 μM之间进行调整。
d 探针浓度：探针终浓度可在50 nM-250 nM之间调整。
e 体系配制：请于超净工作台内配制，并使用无核酸酶残留的枪头、反应管；推荐使用带滤芯的枪头。避免交叉污染和气溶胶污染。
f 模板稀释：一步法RT-qPCR灵敏度极高，推荐将模板稀释后(如稀释至2-5 μL/样本)加入反应体系中，这样可以有效提高实验的重复性。
g 反应体系：建议以大体系进行实验，如20 μL或50 μL。
标准扩增程序
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反应阶段 |
温度 |
时间 |
循环数 |
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1 |
逆转录 |
50℃a |
15 minb |
1 |
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2 |
预变性 |
95℃ |
30 sec |
1 |
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3 |
扩增反应 |
95℃ |
10 sec |
45 cycles |
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60℃ |
30 secc |
【注】:
a 对于含复杂二级结构或高GC含量的RNA模板，可将逆转录温度提高到55℃，有助于提升扩增效率和灵敏度。
b 逆转录时间可以根据模板的复杂程度进行调整，时间为5min时可满足大多数基因的鉴定。
c 不同的qPCR检测仪器所需的荧光信号采集时间不同，请根据最短时间限制进行设置。
HB220304
