通过上期《手把手教你做出RT-qPCR最美曲线(三)：逆转录酶，你真的了解吗？》一文的学习，相信大家对逆转录酶有了一定的了解，但选对了逆转录酶并不意味着你的逆转录实验就大功告成，逆转录引物的正确选择也是重要一环。根据不同实验目的，逆转录引物的选择也是大相径庭。接下来，小翌与大家一同学习下逆转录引物的相关知识，学会如何正确选择逆转录引物。

PART 01

逆转录引物介绍

1

Oligo（dT）

Oligo(dT)是多聚胸腺嘧啶、T重复寡核苷酸，就是只有胸腺嘧啶组成的核苷酸链。因为Oligo(dT)与mRNA的Poly(A)尾巴可以发生特异性结合，所以用Oligo(dT)特异结合到mRNA上Poly(A)尾端，因此，主要用于逆转带有Poly(A)尾的mRNA。例如模板为真核生物来源，Oligo(dT)可与mRNA的3’Poly(A)尾配对，有利于长链或全长mRNA的逆转录。但是，其对RNA样品的质量要求较高，不允许其降解，否则全长cDNA合成量会大量减少。

2

随机引物

随机引物是指当特定mRNA由于含有使逆转录酶终止的序列而难于拷贝其全长序列时，可采用随机六聚体这一不特异的引物来拷贝全长mRNA，一般6到8个碱基，许多随机引物组成一套引物组。它可用于mRNA、rRNA、tRNA等各种RNA的逆转录，对于目标区域具有复杂二级结构/GC含量较高，或者来源为原核生物的模板也同样适应。

3

基因特异性引物

基因特异性引物（GSP）是某个基因序列的一部分，与模板互补的引物。该引物需要结合目标RNA的已知序列进行设计的。由于引物和RNA序列特异性结合，每个目标RNA都需要一套新的基因特异性引物。因此，当分析多种目标时，则需要适用更多的RNA样本。通常特异性引物用于一步RT-qPCR实验中。

PART 02

逆转录引物优劣势比较

引物类型	结合部位	优点	缺点
Oligo(dT)	真核生物mRNA3’端poly(A)尾	可合成全长cDNA	1、仅扩增有polyA尾的mRNA 2、对模板质量要求高
随机引物	RNA的许多随机可结合部位	适合复杂结构和微量模板	特异性低，小片段多
基因特异性引物	特异性互补序列	特异性强，灵敏度高	仅合成特定的序列

PART 03

逆转录引物的选择

RNA类型：

1、真核生物mRNA

2、miRNA、核糖体RNA和tRNA等小RNA前体加A尾处理后的模板

引物选择：Oligo(dT)

原因：

1、真核生物mRNA含有poly(A)尾，可以Oligo(dT)引物结合

2、miRNA、rRNA和tRNA本身无A尾，故需要人工处理后才能与Oligo(dT)引物结合

RNA类型：

1、rRNA、tRNA、原核生物mRNA等无3’端poly(A)尾的模板

2、长度比较长、有二级结构存在及微量样本的模板

引物选择：随机引物

原因：

随机引物可以在任意位点和RNA结合并开始反转

RNA类型：

1、已知基因序列的模板

2、miRNA增加茎环结构的模板

引物选择：基因特异性引物

原因：

1、针对特定序列设计的反转录引物

2、miRNA（茎环法）的反转录，需要根据基因序列设计对应的引物

【注】:为提高反转录效率，并保障获得更加完整的cDNA，建议将Oligo(dT)和随机引物混合使用。

PART 04

精品推荐

为方便大家对逆转录引物的选择，翌圣生物通过基因工程技术开发出Hifair^®III系列逆转录试剂盒，包括两种引物形式：单独成管的oligo(dT)、random primer和按比例预混的oligo(dT)、random primer。其中，按比例预混的引物仅适用与qPCR实验中。

RNA类型	引物选择	原因
1、真核生物mRNA 2、miRNA、核糖体RNA和tRNA等小RNA前体加A尾处理后的模板	Oligo(dT)	1、真核生物mRNA含有poly(A)尾，可以Oligo(dT)引物结合 2、miRNA、rRNA和tRNA本身无A尾，故需要人工处理后才能与Oligo(dT)引物结合
1、rRNA、tRNA、原核生物mRNA等无3’端poly(A)尾的模板 2、长度比较长、有二级结构存在及微量样本的模板	随机引物	随机引物可以在任意位点和RNA结合并开始反转。
1、已知基因序列的模板 2、miRNA增加茎环结构的模板	基因特异性引物	1、针对特定序列设计的反转录引物 2、miRNA（茎环法）的反转录，需要根据基因序列设计对应的引物

PART 05

Hifair^® Ⅲ 系列逆转录酶性能展示

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可耐受60℃反应温度，适合具有复杂二级结构的RNA模板的逆转录

图1. 以500 ng 293T细胞的总RNA为模板.jpg

图1. 以500 ng 293T细胞的总RNA为模板, 使用Hifair^® Ⅲ逆转录酶 (Cat NO.11139ES) 在42℃-65℃下进行逆转录。取1 μL cDNA为模板, 使用Hieff^® Canace Gold 高保真酶 (Cat NO.10148ES)扩增TFRC基因（4.4kb）。M:1 kb DNA ladder.

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优越的延伸性能，可合成19.8kb的cDNA

以500 ng 293T细胞的总RNA为模板.png

图2. 以500 ng 293T细胞的总RNA为模板，oligo dT为引物，使用Hifair^®Ⅲ逆转录酶 (Cat NO.11139ES)合成cDNA。取1 μL cDNA为模板，使用Hieff^® Canace Gold 高保真酶(Cat NO.10148ES)扩增DY1C1N1基因（19.9 kb）5’端的500 bp。M: 1 kb DNA ladder.

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线性检测范围广，Total RNA 10 pg-5 μg

图3 以10 pg-5 μg的293T细胞的总RNA为模板.jpg

图3. 以10 pg-5 μg的293T细胞的总RNA为模板，使用Hifair^®Ⅲ逆转录酶预混液 (Cat NO.11141ES)合成cDNA。取1 μL cDNA为模板，使用Hieff UNICON^® Power qPCR 预混液 (Cat NO.11195ES)扩增PTTG1基因。

PART 06

相关产品

产品定位	产品名称	货号
单酶	Hifair ®II Reverse Transcriptase	11110ES92/93
高灵敏度单酶	Hifair® III Reverse Transcriptase	11111ES92/93
Kit	Hifair®II 1st Strand cDNA Synthesis Kit	11119ES60
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预混液	Hifair® Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix	11120ES60
预混液（含gDNA去除步骤）	Hifair® II 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR (gDNA digester plus)	11123ES60
高灵敏预混液（含gDNA去除步骤）	Hifair® III1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR (gDNA digester plus)	11141ES60

PART 07

翌圣逆转录产品已发表文献（部分）

[1] Liu C X, Li X, Nan F, et al. Structure and degradation of circular RNAs regulate PKR activation in innateimmunity[J]. Cell, 2019, 177(4): 865-880. e21.（IF31.398）

[2] Fan H, Hong B, Luo Y, et al. The effect of whey protein on viral infection and replication of SARS-CoV-2and pangolin coronavirus in vitro[J]. Signal transduction and targeted therapy, 2020, 5(1): 1-3. (IF13.493)

[3] Wang J., et al., The mycobacterial phosphatase PtpA regulates the expression of host genes and promotescell proliferation[J]. Nat Commun. 2017 Aug 15;8(1):244.（IF 12.353）

[4] Zhou L, Hou B, Wang D, et al. Engineering Polymeric Prodrug Nanoplatform for Vaccinatio Immunotherapy of Cancer[J]. Nano Letters, 2020.（IF12.279）

[5] Xu L, Xu S, Sun L, et al. Synergistic action of the gut microbiota in environmental RNA interference in a leaf beetle[J]. Microbiome, 2021, 9(1). (IF 11.607)

以上是小翌本期给大家分享的内容，主要介绍了逆转录引物的种类、优缺点和选择应用。下期，我们将给大家分享逆转录实验中的一些注意事项，我们下期不见不散哦~

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