microRNA是一类被广泛关注的非编码RNA，长度为22 nt左右，对植物和动物的基因表达有着非常重要的调控作用。本试剂盒采用SYBR^® Green I嵌合荧光法的原理进行miRNA荧光定量检测。本产品中的2×Hieff^® miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix是专门为miRNA定量检测而研发的新一代预混形式的荧光定量PCR检测试剂，含有特殊的ROX Passive Reference Dye，适用于所有qPCR仪器，无需在不同的仪器上调整ROX的浓度，只需在配制反应体系时加入引物和模板即可进行扩增。DNA Polymerase采用化学修饰的热启动聚合酶，配合特殊的Buffer体系，使反应特异性更好，灵敏度更高，并能在更广的范围内进行准确定量。

本产品必须与本公司的Hifair^® miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit（加A法）(Cat#11148ES)配套使用，以获得最终的实验结果。

 

产品组分

组分编号	组分名称	产品规格
		11171ES03 (20 μL×100 rxn)	11171ES08 (20 μL×500 rxn)
11171-A	2×Hieff® miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix	1 mL	5×1 mL
11171-B	RNase-free H2O	2×1 mL	5×1 mL

 

运输与保存方式

冰袋运输。-20℃避光保存，有效期1年。

 

需自备的试剂及耗材

1）无核酸酶污染的枪头及离心管。

2）PCR上游引物（Forward Primer）。

 

Forward Primer设计原则

通常以成熟的miRNA序列为基础，将U替换成T。Tm值建议在65℃左右。可适当在引物的5’端添加若干个G或C碱基以增加Tm值，也可适当在5’或3’端去掉若干碱基以减少Tm值，注意避免引入二级结构。

 

注意事项

1）使用前，将冻存的各组分充分融解并轻轻混匀后使用。

2）实验时，请尽量使用无污染的耗材，避免污染。

3）本产品避免反复冻融，配制时应避免强光照射。

4）为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

5）本产品仅作科研用途！

 

操作步骤

一、体系配制

1）将试剂放置室温下融化，使用前上下颠倒，轻轻混匀，并轻微离心后使用，避免起泡。

2）将试剂置于冰上，按照下表配制试剂。RNase-free H₂O可替换为其他用于分子生物学实验的无核酸酶水。

【注】：没有混匀试剂、使用振荡器混匀、未在冰上配置试剂等会导致反应性能下降。

3）荧光定量PCR体系配制

组分	体积 (μL)	体积 (μL)	终浓度
2×Hieff® miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix	10 μL	25 μL	1 ×
Forward Primer（自备）	X	X	400 nM
Reverse Primer (10 μM)	0.8 μL	2 μL	400 nM
cDNA	X	X	-
RNase-free H2O	Up to 20 μL	Up to 50 μL	-

【注】：a) miRNA第一链cDNA的加入量不要超过qRT-PCR体积的1/10。高浓度cDNA易导致非特异扩增，可对cDNA适当稀释10-1000倍。

b) Reverse Primer (10 μM) 来源于试剂盒11148ES。由于专利的保密性，miRNA加A法反转录后，cDNA下游引物序列不同厂商之间存在差异，建议使用翌圣加A法反转录试剂盒11148ES，以保证最终的实验结果。

 

二、PCR反应程序设置

可参考以下两个程序进行定量PCR反应。

a. 荧光定量PCR常规扩增程序（两步法）

循环步骤	温度	时间	循环数
预变性	95℃	10 min	1
变性	95℃	15 sec	35-40
退火/延伸	60℃	20 sec
熔解曲线阶段	仪器默认设置		1

b. 荧光定量PCR快速扩增程序（两步法）

循环步骤	温度	时间	循环数
预变性	95℃	10 sec	1
变性	95℃	5 sec	40
退火/延伸	60℃	20 sec
熔解曲线阶段	仪器默认设置		1

【注】：

1）退火/延伸温度和时间可根据实验要求适当调整。

2）常规程序与快速程序根据实验仪器选择，例如：ABI QuantStudio 5等仪器可以进行快速程序设置，Bio-Rad CFX96等仪器不可设置快速程序，需要进行常规程序设置。

 

HB221202