Hifair® Advanced One Step RT-qPCR SYBR Green Kit是一款基于SYBR Green I染料进行荧光定量的试剂盒。使用基因特异性引物，反转录和qPCR反应在一管内完成，无需反复的开盖和移液操作，大大提高了检测效率，并降低了污染的风险。对于RNA样本，试剂盒采用耐热Hifair® V Reverse Transcriptase高效合成cDNA，同时采用UNICON® HotStart Taq DNA Polymerase进行定量扩增。在优化的缓冲体系下，该试剂盒的检测灵敏度针对高表达的靶标, 可以检至0.1 pg，中等表达的靶标，可以检至1 pg。该试剂盒同时也适用于DNA样本的扩增定量。该试剂盒可实现不同动植物样本、细胞、微生物核酸的高灵敏检测和定量。

 

组分信息

组分编号	组分名称	11175ES20	11175ES70
11175-A	2× Hifair® Advanced SG Buffer	250 μL	2×1.25 mL
11175-B	Hifair® Advanced UH Enzyme Mix	20 μL	200 μL
11175-C	RNase free H2O	250 μL	2×1.25 mL

 

储存条件

-25~-15℃避光储存，有效期1年。

 

使用说明

1. 推荐反应体系

组分	体积（μL）****	体积（μL）	终浓度
2× Hifair® Advanced SG Buffer	12.5	25	1×
Hifair® Advanced UH Enzyme Mix	1	2	-
Forward Primer (10 μM)**	0.5	1	0.2 μM
Reverse Primer (10 μM)**	0.5	1	0.2 μM
模板 RNA***	X	X
RNase-free ddH2O	to 25	to 50

表1反应体系*****

** 通常引物终浓度为0.2 μM，也可根据情况在0.1-1 μM之间进行调整。

*** 该试剂灵敏度极高，Total RNA在1 pg – 1 μg，人源样本测试显示最佳投入量为1 pg – 100 ng，控制Ct值整体在15-30之间为宜。

**** 推荐使用20 μL或 50 μL，以保证目的基因扩增的有效性和重复性。

***** 请于超净工作台内配制，并使用无核酸酶残留的枪头、反应管；推荐使用带滤芯的枪头。避免交叉污染和气溶胶污染。

 

2. 反应程序

循环步骤	温度	时间	循环数
反转录	50℃*	6 min	1
预变性	95℃	5 min	1
扩增反应	95℃	15 sec	40
	60℃**	30 sec
熔解曲线	仪器默认设置		1

表2 标准扩增程序

* 反转录温度可根据实验需求在50-55℃之间进行选择。对于DNA样本，反转录过程可省去。

** 特殊情况下退火/延伸温度可根据引物Tm值进行调整，建议使用60℃。

 

3. 适用机型

不需要Rox校正的仪器型号：

Bio-Rad: CFX96, CFX384, iCycler iQ, iQ5, MyiQ, MiniOpticon, Opticon, Opticon 2, Chromo4;

Eppendorf: Mastercycler ep realplex, realplex 2 s;

Qiagen: Corbett Rotor-Gene Q, Rotor-Gene 3000, Rotor-Gene 6000;

Roche Applied Science: LightCycler 480, LightCycler2.0, Lightcycler 96;

Thermo Scientific: PikoReal Cycler; Cepheid: SmartCycler; Illumina: Eco qPCR;

Low Rox适用机型： ABI 7500, 7500 Fast, ViiA7, QuantStudio 3 and 5, QuantStudio 6, 7, 12k Flex;

Stratagene MX3000P, MX3005P, MX4000P;

High Rox适用机型： ABI 5700, 7000, 7300, 7700, 7900HT Fast, StepOne, StepOne Plus.

 

4. 引物设计技巧

1）引物最好应设计成跨越一个外显子-外显子连接，其中一条扩增引物可以潜在地跨越实际外显子-内含子边界。这种设计可以减少从污染的基因组DNA中扩增到假阳性的风险。

2）引物应具有特异性。引物设计完成以后，应对其进行BLAST检测。

3）引物长度一般在18~27 bp，不应过长否则导致其延伸温度过高，不适于Taq DNA 聚合酶反应。

4）引物GC含量在40%~60%，GC含量过高或过低都不利于反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。另外，上下游引物的Tm值是寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下，50%寡核苷酸双链解链的温度。有效启动温度，一般高于Tm值5~10℃。可按公式Tm= 4（G+C）+2（A+T）估算引物的Tm值，也可以通过软件计算引物Tm值。

5）PCR产物的长度通常控制在80-300 bp,为了保证扩增效率，在设计引物时要考虑PCR产物的长度。

6）引物3′端末端尽量避免为A，引物3′端错配时，不同碱基引发效率存在着很大的差异，当末位的碱基为A时，即使在错配的情况下，也能有引发链的合成，而当末位链为T时，错配的引发效率大大降低，G、C错配的引发效率介于A、T之间，所以3′端最好选择T。

7）碱基要随机分布，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3′端不应超过3个连续的G或C，因这样会使引物在GC富集序列区错误引发。

8）引物自身及引物之间避免存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹结构使引物本身复性。这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。引物自身不能有连续4个碱基的互补。两引物之间也不应具有互补性，尤其应避免3′ 端的互补重叠以防止引物二聚体的形成。引物之间不能有连续4个碱基的互补。引物二聚体及发夹结构如果不可避免的话，应尽量使其DG值不要过高（应小于4.5 kcal/mol）。否则易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR 反应不能正常进行。

 

5. 异常结果分析

1. 无Ct值出现

1. 采集荧光信号的步骤有误：在退火/延伸结束采集信号；
2. 引物降解：可通过PAGE电泳检测其完整性；
3. 模板量不足：对未知浓度的样品应从原液开始测试；
4. 模板降解：避免样品制备中杂质的引入及反复冻融的情况。

2. Ct值偏大 (Ct >35)

1. 扩增效率低：反应条件不够优化，引物设计存在问题，可试用三步法进行反应，也可适当降低退火温度等；
2. PCR产物太长：一般采用80-150bp的产物长度。

3)  标准曲线线性关系不佳

a.  加样存在误差：使得标准品不呈梯度；RNA模板推荐使用1×TE缓冲液（Cat #60143ES）进行梯度稀释，DNA模板推荐使用ddH₂O稀释;

b.  标准品出现降解：应避免标准品反复冻融，或重新制备并稀释标准品；

c.  引物设计不佳：重新设计引物；

d.  模板中存在抑制物，或模板浓度过高。

4)  NTC有扩增（Ct<32）

a.  引物设计不够优化：应避免引物二聚体和发夹结构的出现；

b.  引物浓度不佳：适当降低引物的浓度，并注意上下游引物的浓度配比；

c.  气溶胶污染：扩增产物泄露很容易在实验室中引发气溶胶污染，一旦污染，定量检测结果就会不准确。推荐使用DNA/RNA Remover 核酸气溶胶污染清除剂（Cat #19702ES）。

 

注意事项

1. 本产品仅作科研用途。

2. 为了您的安全和健康，请穿实验服并佩戴一次性手套操作。

3. 加样和配液步骤都尽量在冰上操作。

4. 每个组分在使用前都应震荡混匀，低速离心。