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产品描述
Hieff® qPCR SYBR Green Master Mix是2×实时定量PCR扩增的预混合溶液。Mix中含有热启动Hieff® DNA Polymerase、SYBR Green I、dNTPs、Mg2+。使用时，仅需在扩增体系中加入模板和引物即可进行实时荧光定量PCR，大大简化操作过程，降低污染几率。本产品针对不同型号的实时荧光定量PCR仪，分别提供不同浓度的 Rox 参比液（High Rox/Low Rox），用于校正孔与孔之间的荧光信号误差。
本品采用的DNA聚合酶配体可以随温度变化实时调节DNA聚合酶活性。配方添加了有效抑制非特异性PCR扩增的因子和提升PCR反应扩增效率的因子，使定量PCR可以在宽广的定量区域内获得良好的线性关系。
产品组分
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组分编号 |
组分名称 |
产品编号/规格 |
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|
11204ES03 （1 mL） |
11204ES08 （5×1 mL） |
11204ES50 （50×1 mL） |
11204ES60 （100×1 mL） |
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|
11204-A |
Hieff® qPCR SYBR Green Master Mix |
1 mL |
5 ×1 mL |
50 ×1 mL |
100 ×1 mL |
|
11204-B |
50×Low Rox |
40 μL |
200 μL |
4 ×500 μL |
8 ×500 μL |
|
11204-C |
50×High Rox |
40 μL |
200 μL |
4 ×500 μL |
8 ×500 μL |
运输与保存方式
冰袋运输。-20℃避光储存，有效期18个月。
本品避免反复冻融。产品中含有荧光染料SYBR® Green I，保存或配制反应体系时需避免强光照射。
注意事项
1. 推荐使用本公司cDNA合成试剂盒（货号：11123ES），以有效去除RNA样品中残留的基因组。
2. 为了您的安全和健康，请穿实验服并佩戴一次性手套操作。
3. 本产品仅作科研用途！
反应体系（推荐冰上配制）
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组分 |
体积（μL） |
体积（μL） |
终浓度 |
|
Hieff® qPCR SYBR Green Master Mix |
25 |
10 |
1× |
|
Forward Primer (10 μM) |
1 |
0.4 |
0.2 μM |
|
Reverse Primer (10 μM) |
1 |
0.4 |
0.2 μM |
|
50×High or Low Rox |
1 |
0.4 |
1× |
|
模板DNA |
X |
X |
- |
|
无菌超纯水 |
to 50 |
to 20 |
- |
【注】： 使用前务必充分混匀，避免剧烈震荡产生过多气泡。
a) 参比染料：Rox的添加，可根据不同仪器型号进行选择，具体可参考【适用机型】。
b) 引物浓度：通常引物终浓度为0.2 μM，也可以根据情况在0.1-1.0 μM之间进行调整。
c) 模板浓度：如模板类型为未稀释cDNA原液，使用体积不应超过qPCR反应总体积的1/10。
d) 模板稀释：cDNA原液建议5-10倍稀释，最佳模板加入量以扩增得到的CT值在20-30个循环为好。
e) 反应体系：推荐使用20 μL或50 μL，以保证目的基因扩增的有效性和重复性。
f) 体系配制：请于超净工作台内配制，并使用无核酸酶残留的枪头、反应管；推荐使用带滤芯的枪头。避免交叉污染和气溶胶污染。
扩增程序
三步法程序 两步法程序
|
循环步骤 |
温度 |
时间 |
循环数 |
循环步骤 |
温度 |
时间 |
循环数 |
|
|
预变性 |
95℃ |
5 min |
1 |
预变性 |
95℃ |
5 min |
1 |
|
|
变性 |
95℃ |
10 sec |
40 |
变性 |
95℃ |
10 sec |
||
|
退火 |
55-60℃ |
20 sec |
退火、延伸 |
60℃ |
30 sec★ |
40 |
||
|
延伸 |
72℃ |
20 sec★ |
||||||
|
熔解曲线 |
仪器默认设置 |
1 |
熔解曲线 |
仪器默认设置 |
1 |
|||
【注】：高特异性可选择两步法，高效率扩增可选择三步法。
a) 预变性时间：根据不同模板和引物的具体情况可适当缩短至2 min。
b) 退火温度和时间：请根据引物和目的基因的长度进行调整。
c) 荧光信号采集（★）：请参考仪器说明书设置。
d) 熔解曲线：通常情况下可以使用仪器默认程序。
结果分析
定量实验至少需要三个生物学重复。反应结束后需要确认扩增曲线及熔解曲线。
1) 扩增曲线：标准扩增曲线为S型。
Ct值落在20-30之间时，定量分析最准确；
Ct值小于10，需要将稀释模板后，重新进行实验；
Ct值介于30-35之间时，需要提高模板浓度，或者增大反应体系的体积，以提高扩增效率，保证结果分析的准确性；
Ct值大于35时，检测结果无法定量分析基因的表达量，但可用于定性分析。
2) 熔解曲线：
熔解曲线单峰，表明反应特异性好可以进行定量结果分析；若熔解曲线出现双峰或者多峰，则不能进行定量分析。
熔解曲线出现双峰，需要通过DNA琼脂糖凝胶电泳判断非目标峰是引物二聚体还是非特异性扩增。
如果是引物二聚体，建议降低引物浓度，或者重新设计扩增效率高的引物。
如果是非特异性扩增，请提高退火温度，或者重新设计更高特异性的引物。
引物设计指南
1）推荐引物长度25 bp左右。扩增产物长度150 bp为佳，可以在100 bp-300 bp内选择。
2）正向引物和反向引物的Tm值相差不宜超过2℃。引物Tm值60ºC-65ºC为佳。
3）引物碱基分布要均匀，避免出现连续的4个相同碱基，GC含量控制在50%左右。3’端最后一个碱基最好为G或C。
4）引物内部或者正反两条引物间最好避免出现有3个碱基以上的互补序列。
5）引物特异性需要用NCBI BLAST程序进行核对。避免引物3’端有2个碱基以上的非特异性互补。
6）设计完成的引物需要进行扩增效率的检测，只有具备相同扩增效率的引物才可用于定量比较分析。
适用机型
High Rox适用机型： ABI 5700, 7000, 7300, 7700, 7900HT Fast, StepOne, StepOne Plus;
Low Rox 适用机型： ABI 7500, 7500 Fast, ViiA7, QuantStudio 3 and 5, QuantStudio6,7,12k Flex; Stratagene MX3000P, MX3005P, MX4000P;
不需要Rox校正的仪器型号：
Bio-Rad CFX96, CFX384, iCycler iQ, iQ5, MyiQ, MiniOpticon, Opticon, Opticon 2, Chromo4;
Eppendorf Mastercycler ep realplex, realplex 2 s; Qiagen Corbett Rotor-Gene Q, Rotor-Gene 3000, Rotor-Gene 6000;
Roche Applied Science LightCycler 480, LightCycler 2.0; Lightcycler 96; Thermo Scientific PikoReal Cycler;
Cepheid SmartCycler; Illumina Eco qPCR.
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产品名称 |
货号 |
规格 |
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