T4 RNA连接酶2|T4 RNA Ligase 2，环状RNA研究核心酶原料

T4 RNA连接酶2 | T4 RNA Ligase 2，环状RNA研究核心酶原料

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2025-02-13

近年来，随着RNA研究的不断深入，线性RNA分子在生物学研究和治疗开发领域展现出广泛的应用潜力，例如mRNA疫苗。然而，长链线性RNA较短的半衰期限制了其有效性。环状RNA (circRNA)是一类单链闭合的环状RNA分子，与线性mRNA相比，circRNA具有稳定性高、免疫原性低、表达持久等优势，已经成为下一代RNA疗法赛道的新秀。circRNA体外环化技术是研究的关键，目前，RNA的体外环化主要通过化学合成和酶促连接（分为T4连接酶法和核酶法）两种方法实现。

在众多技术路线中，基于T4连接酶法的技术路线备受关注。该技术路线主要涉及到T4 DNA Ligase 1、T4 RNA Ligase 1以及T4 RNA Ligase 2这几种关键酶。值得注意的是，不同的T4连接酶在功能方面存在着显著的差异，这种差异决定了它们各自适用于不同结构的RNA连接任务。其中，T4 RNA Ligase 2在对双链RNA缺口进行连接时，展现出了极高的连接效率。

图1. T4连接酶作用原理比较^[1]

T4 RNA Ligase 2，是一种依赖于ATP的双链RNA连接酶（double-strand RNA ligase, dsRNA Ligase），具有RNA链分子间和分子内连接活性，可连接双链RNA中的切刻，也可用于连接双链结构中RNA 3´羟基与DNA 5´磷酸基的切刻。与T4 RNA Ligase 1相比，该酶对双链RNA切刻的连接活性要明显高于对单链RNA的末端连接。

T4 RNA Ligase 2能够通过三步反应将相邻的3´羟基与5´磷酸多核苷酸连接起来，其机理如下：

①连接酶与ATP反应形成酶-AMP复合中间体；

② AMP脱离酶-AMP复合体，与RNA的5’-磷酸结合，形成5’端腺苷化的RNA；

③ 5’端腺苷化的RNA与3’-OH连接形成磷酸二酯键，释放AMP。

图2.T4连接酶结构与作用机理^[2][3]

翌圣T4 RNA Ligase 2(Cat#14652) 性能展示

连接活性强

将Yeasen和进口Supplier N*的T4 RNA Ligase 2按照不同投入量加入体系中对dsRNA底物进行连接，结果显示其能有效连接dsRNA底物，连接效果与进口Supplier N*相当。

图3. T4 RNA Ligase 2连接效果验证

注：20 μL反应体系中包含终浓度为20 μM的dsRNA连接底物

无核酸外切酶、切口酶、RNase酶残留

将100 U T4 RNA Ligase 2分别与核酸底物一起孵育，琼脂糖凝胶电泳比较谱带变化。结果显示翌圣3个批次的T4 RNA Ligase 2均无核酸外切酶、切口酶、RNase残留。

图4. T4 RNA Ligase 2核酸外切酶、切口酶、RNase残留检测结果

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T4 RNA连接酶类型	T4 RNA Ligase 1(T4 Rnl 1) （Cat#14651）	T4 RNA Ligase 2 (T4 Rnl 2）（Cat#14652）	T4 RNA Ligase 2, truncated K227Q （Cat#14655）	T4 RNA Ligase 2, truncated KQ （Cat#14653）
主要应用	单链RNA连接	双链RNA连接	与T4 Rnl2tr相似，但减少了副产物	与T4 Rnl2tr相似，但减少了副产物
ATP依赖性	是	是	否	否
连接子要求	不需要预腺苷化的连接子	不需要预腺苷化的连接子	需要预腺苷化的连接子	需要预腺苷化的连接子
酶活性	高	高	高，相比T4 Rnl2tr，减少副产物	高，相比T4 Rnl2tr，减少副产物，连接活性一致
特点	无特定突变	无特定突变	ATP非依赖性，K227Q突变减少了酶的赖氨酸腺苷化活性	ATP非依赖性，K227Q突变减少了酶的赖氨酸腺苷化活性， R55K突变提高了酶的连接活性
优势	广泛应用于单链RNA连接	广泛应用于双链RNA连接	减少了副产物	优化了连接效率，减少了副产物
应用	1. ssRNA分子内/间连接和环化； 2. ssRNA和ssDNA分子间连接; 3. 单链Oligo RNA的合成； 4.miRNA等5’端RNA在克隆、建库或PCR检测时接头添加、cDNA文库构建。	1. 连接双链RNA中缺刻的连接； 2. RNA 3'羟基与DNA 5'磷酸基的缺刻连接； 3. 在RNA夹板的帮助下实现ssRNA末端的连接，但不适用于短RNA前体。	miRNA等3’端羟基的单链RNA在克隆、建库或PCR检测时接头添加、cDNA文库构建

参考文献:

[1]Obi P, Chen Y G. The design and synthesis of circular RNAs[J]. Methods, 2021, 196: 85-103.

[2]Easey A. Synthetic Biology Methods to Optimise T4 RNA Ligase Activities[D]. University of East Anglia, 2018.

[3] Viollet S, Fuchs R T, Munafo D B, et al. T4 RNA ligase 2 truncated active site mutants: improved tools for RNA analysis[J]. BMC biotechnology, 2011, 11: 1-14.

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