T4 DNA连接酶(T4 DNA Ligase)实战指南：酶切-连接全流程实战，从载体处理到转化
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2026-07-14
酶切-连接（Restriction Digestion + Ligation）是分子克隆最经典、使用最广泛的技术路线。然而，从双酶切策略、载体去磷酸化到连接体系优化，每一步都藏着影响阳性率的细节。本文以翌圣Hieff® Gold T4 DNA Ligase（Cat#10300ES）为核心，梳理从载体处理到获得克隆的完整操作流程。
一、双酶切：克隆成功的基石
1.1 限制酶的选择策略
· 优先选择产生不同突出端的两种酶（如EcoRI + HindIII），避免使用产生相同粘性末端的同尾酶（如BamHI + BglII），后者可能导致载体自连。
· 确认两种限制酶的Buffer兼容性。优先选择可使用同一Buffer的酶对，减少中间纯化步骤。翌圣FuniCut®系列限制性内切酶共用一种酶切缓冲液，能大大简化酶切反应体系。
· 载体多克隆位点（MCS）的选择：确保酶切后不会破坏载体上的筛选标记（抗生素抗性、LacZ等）。
1.2 酶切体系参考（50 μL体系）
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组分 |
用量 |
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质粒载体 |
1-2 μg |
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10× FuniCut® 缓冲液 |
5 μL |
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限制酶 A |
1-2 μL |
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限制酶 B |
1-2 μL |
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ddH₂O |
To 50 μL |
在限制性内切酶最适酶切温度下酶切15 min（质粒）、或15-30 min（PCR产物）、或30-60 min（基因组DNA）。酶切完成后，建议取2-3 μL跑胶验证酶切是否完全。超螺旋质粒的酶切不完全是最常见的自连来源之一。
1.3 酶切后纯化
酶切完成后必须纯化产物，目的有二：去除切下的小片段（stuffer fragment），防止其竞争性连接回载体；去除限制酶，避免干扰后续连接反应。推荐使用胶回收（MolPure® Fast Gel Extraction Kit 快速琼脂糖凝胶回收试剂盒（Cat#19101ES））或PCR纯化柱（MolPure® PCR Purification Kit PCR产物纯化试剂盒（Cat#19106ES）），最终溶于20-30 μL ddH₂O或TE缓冲液中。
二、载体去磷酸化：降低背景的关键步骤
如果使用单酶切、或双酶切后阳性率仍不理想，强烈建议对线性化载体进行去磷酸化处理。去磷酸化酶可去除载体5'-磷酸基团，使其无法自连，但保留3'-OH可接受外源片段连接。
· 推荐使用使用Antarctic Phosphatase (Anp) Anp（Cat#14511ES）或Alkaline Phosphatase, Calf Intestine (CIAP)（Cat#14511ES），高效去除DNA/RNA的5'-磷酸基团。
· 操作：纯化后的线性化载体 + 1-2 μL AnP，37°C孵育15-60 min；随后75°C孵育5 min热灭活或纯化后，直接用于后续实验。
三、连接反应：T4 DNA Ligase的核心环节
3.1 Insert:Vector摩尔比计算
插入片段用量计算：
插入片段(ng) = 载体(ng) × 插入片段长度(bp) / 载体长度(bp) × 摩尔比
示例：50 ng 载体（3000 bp），连接 500 bp 插入片段，摩尔比 3:1：
插入片段 = 50 × 500/3000 × 3 ≈ 25 ng
3.2 连接体系配制（20 μL体系）
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组分 |
用量 |
备注 |
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新鲜 PCR 产物 |
片段与载体的分子摩尔比应在 3:1-5:1 |
尽量使用新鲜产物（24 h 内） |
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载体DNA |
50-100 ng |
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10× Ligase Buffer |
2 μL |
含 ATP，避免反复冻融 |
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Hieff® Gold T4 DNA Ligase（10300ES，5 U/μL） |
1 μL |
冰上取用 |
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ddH₂O |
补至 20 μL |
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【注】：平末端载体与 DNA 片段进行连接时，应先将载体进行去磷酸化处理（可选用Antarctic Phosphatase Cat#14511ES），以防发生自连接现象。为提高连接效率，每20 μL 反应体系中可以加 2 μL 50% PEG 4000。
3.3 反应条件
16°C 连接 1-4 小时（推荐过夜以获得最大效率）或室温（22-25°C）连接 1-2 小时。
四、转化：从连接产物到克隆的最后一步
4.1 化学转化（推荐）
a. 将连接产物加入到 100 μL 感受态细胞中（连接产物不应超过感受态细胞的 1/10），轻弹混匀，冰上孵育 30 min。
b. 将离心管于 42℃，热激 90 sec（不要晃动），之后立刻置于冰水浴静置 2-3 min。
c. 向离心管中加入 900 μL LB 或 SOC 培养基，37℃，150 rpm，振荡培养 45 min，该过程使菌体复苏，抗性基因表达。
d. 2500 g 离心 5 min，吸去 900 μL 上清，用剩余培养基重悬菌体，用无菌涂布棒将剩余菌体在正确抗性的平板上涂布均匀，待菌液被平板吸收后，37℃倒置培养过夜。
【注】：如果使用超级感受态细胞（转化效率＞108 cfu/μg），可直接吸取 100-200 μL 37℃孵育后的菌液涂板，剩余菌液可在2-8℃保存，1 周内均可重新涂板。
4.2 电转化（如必须使用）
⚠ 连接产物必须先纯化（PCR纯化柱或乙醇沉淀），去除盐离子和PEG，否则会导致电转时电弧，损坏电转杯并严重降低转化效率。纯化后的连接产物溶于10 μL ddH₂O，取1-2 μL用于电转。
五、关键注意事项速查
· 酶切完全性：超螺旋质粒和线性化质粒在凝胶上的迁移位置不同，跑胶确认酶切完全后再进行后续操作。
· 去磷酸化后纯化：CIAP（10321ES）处理后必须纯化载体，防止残留CIAP干扰连接。
· 载体用量：50-100 ng载体/10 μL连接体系即可，无需过多。载体过量会增加自连背景。
· 连接酶量：10301ES浓度为400 U/μL，常规连接用0.5-1 μL即可；平端连接可增加至1-2 μL。
· 阴性对照：每次实验务必设置"载体自连对照"（只加载体，不加片段），用于评估载体自连背景。
· 阳性对照：如有条件建议设置阳性对照（已知可成功连接的载体+片段组合），验证整个流程正常。
六、相关产品推荐
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产品类型 |
产品名称 |
货号 |
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DNA连接酶 |
10300ES |
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11051ES |
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磷酸酶 |
14511ES |
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10321ES |
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10322ES |
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一步法克隆试剂盒 |
10923ES |
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|
TOPO克隆试剂盒 |
10906ES |
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|
PCR mix |
10167ES |
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|
高保真酶 |
10166ES |
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|
T5核酸外切酶 |
14538ES |
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|
TOPO异构酶 |
14971ES |
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感受态细胞 |
11803ES |
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核酸染料 |
10202ES |
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琼脂糖 |
10208ES |
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DNA marker |
10501ES |
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|
限制性内切酶 |
15000ES-15300ES |
