Q：最后一步扩增，短接头中Primer 和长接头的Primer 是否一致？

A：不一致。

短接头建库：接头连接时候是连接一样的双端接头 PE Adapter,后期进行文库扩增再利用不同的 Index Primer 扩增出完整携带不同的 DNA 文库。

长接头建库：接头连接时候的连接的是带有不同 Index 的完整接头，后期扩增的时候再用两端的通用引物Primer Mix 扩增完整的文库，使用长接头时，若在 PCR 扩增之前文库浓度就达到上机要求，则无需进行PCR 文库扩增。

Q：接头中index/Barcode 组合原则是什么？

A：碱基平衡，荧光平衡（详情可查看翊圣生物公众号微信软文 一文全面解析 NGS 接头的奥秘 ）

Q：双端接头，连接过程的注意事项，长接头和短接头有区别吗？

A：长接头带完整的 index 序列，所以接头连接的时候直接完成文库构建，此时如果文库浓度达到测序要求，那么可以直接PCR-Free 建库；短接头建库，接头连接步骤双端同时连接相同的 PE Adapter。序列如下：

PE Adapter for Illumina：

5 -/5Phos/ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTC -3

5 -ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3

其中黄色部分是Y 型接头配对的区域（12 bp）

而后必须必须经过 1-3 循环的扩增形成完整的接头序列。以单端为例：

Universal Primer for Illumina：

5 -AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT -3

蓝色部分（33 bp）与 PE Adapter 5 -ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3 互补延伸之后形成 i5

端。

Index Primer for Illumina：

5 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATXXXXXXXXGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATC-3

（ xxxxxxxx 代 表 index ） 红 色 部 分 (31 bp) 与 PE Adapter 5 -/5Phos/ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTC -3 互补延伸形成完整的 i7 端.

Q：双端接头 p5，p7 端的index 是重复的吗？有对应的示意图或者使用说明吗？

A：不是的，双端的 i5 端有 16 种 index，i7 端有 24 种 index，两者组合之后可以达到 384 种 index 组合.单端/双端 index 接头示意图如下：

Q：接头连接之后可以直接进行分选吗？

A：不可以，Ligation Enhancer 内含高浓度的 PEG，会对分选造成显著影响，所以接头连接后如果进行片段分选必须先纯化。

Q：说明书中说载体需要去磷酸化处理，但是连接原理不是催化形成磷酸二酯键吗，那载体进行去磷酸化处理后如何跟目的片段连接成环呢？不会有个缺口吗？

A: 插入片段的3' 末端与载体的5' 末端之间有一个缺刻，可在大肠杆菌中自动进行修复。