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干货 | T4 RNA Ligase 2:结构・机理・应用全解析

在分子生物学的精密实验体系中,酶分子犹如高度特化的"分子手术刀",以其卓越的催化特异性和反应效率,精准调控着核酸操作、蛋白修饰等核心生物学过程,为现代分子生物学研究提供了不可或缺的技术支撑。该酶兼具RNA链分子间与分子内连接活性,既能精准连接双链RNA中的切刻位点,又可实现双链结构中RNA 3´羟基与DNA 5´磷酸基的切刻连接。与同家族的T4 RNA Ligase 1相比,其对双链RNA切刻的连接活性显著高于单链RNA末端连接,成为双链RNA切刻连接研究的核心工具。

图1. T4 RNA Ligase 2作用底物示意图

T4 RNA Ligase 2分子结构解析

T4 RNA Ligase 2由噬菌体T4的24.1基因编码,分子量约37 kDa,隶属于ATP依赖型连接酶家族。其分子结构包含 I、III、IIIa、IV、V等多个高度保守的功能域,这些功能域通过精密的空间排布形成稳定的核苷酸结合口袋,为催化反应提供了高效的结构基础。更为关键的是,Glu-34、Arg-55、Lys-209等关键氨基酸在活性中心的精准定位,使其在RNA与DNA的连接反应中同时具备高催化活性与底物特异性,确保反应的精准高效进行。[1]

图2. T4 RNA Ligase 2结构图[2]

T4 RNA Ligase 2催化作用机理

T4 RNA Ligase 2 通过三步有序的催化反应实现相邻核苷酸的连接,其作用机理体现了分子层面的精准调控:

①连接酶与ATP反应形成酶-AMP复合中间体;

② AMP脱离酶-AMP复合体,与RNA的5’-磷酸结合,形成5’端腺苷化的RNA;

③ 5’端腺苷化的RNA与3’-OH连接形成磷酸二酯键,释放AMP。

图3. T4 RNA Ligase 2催化作用机理图[3]

翌圣 T4 RNA Ligase 2

Cat#14652ES

基于T4 RNA Ligase 2的核心结构与作用机理,翌圣生物通过优化表达体系与纯化工艺,成功研发出高性能的T4 RNA Ligase 2(Cat#14652)。该产品在保留酶天然催化活性的同时,通过多步纯化工艺剔除杂酶干扰,为科研人员提供稳定可靠的实验工具。以下将从连接活性与纯度控制两个核心维度,展示其关键性能指标。

高效连接活性,媲美进口品质

将Yeasen和进口Supplier N*的T4 RNA Ligase 2按照不同投入量加入体系中对dsRNA底物进行连接,结果显示其能有效连接dsRNA底物,连接效果与进口Supplier N*相当。

图4. T4 RNA Ligase 2连接效果验证

注:20 μL反应体系中包含终浓度为20 μM的dsRNA连接底物。

高纯度无残留,保障实验准确性

将100 U T4 RNA Ligase 2分别与核酸底物一起孵育,琼脂糖凝胶电泳比较谱带变化。结果显示翌圣3个批次的T4 RNA Ligase 2均无核酸外切酶、切口酶、RNase残留,彻底消除了非特异性酶活性对实验的干扰风险。

图5. T4 RNA Ligase 2核酸外切酶、切口酶、RNase残留检测结果

目前,翌圣生物已构建起覆盖不同研究需求的T4 RNA连接酶产品矩阵,包括T4 RNA Ligase 1(Cat#14651)、T4 RNA Ligase 2(Cat#14652)及T4 RNA Ligase 2, truncated KQ(Cat#14653),为科研人员提供精准匹配的工具选择:

T4 RNA连接酶类型

T4 RNA Ligase 1 (Cat#14651)

T4 RNA Ligase 2 (Cat#14652)

T4 RNA Ligase 2, truncated KQ (Cat#14653)

连接特性

单链RNA连接

双链RNA连接

预腺苷化的5'端DNA或RNA与RNA的3'端连接

ATP依赖性

连接子要求

不需要预腺苷化的连接子

不需要预腺苷化的连接子

需要预腺苷化的连接子

优势

广泛应用于单链RNA连接

广泛应用于双链RNA连接

优化了连接效率,减少了副产物

应用

1. ssRNA分子内/间连接和环化;

2. ssRNA和ssDNA分子间连接;

3. 单链Oligo RNA的合成;

4. miRNA等5’端RNA在克隆、建库或PCR检测时接头添加、cDNA文库构建。

1. 连接双链RNA中缺刻的连接;

2. RNA 3'羟基与DNA 5'磷酸基的缺刻连接;

3. RNA夹板的帮助下实现ssRNA末端的连接,但不适用于短RNA前体。

miRNA等3’端羟基的单链RNA在克隆、建库或PCR检测时接头添加、cDNA文库构建。

参考文献:

[1] Yin S, Ho C K, Shuman S. Structure-function analysis of T4 RNA ligase 2[J]. Journal of Biological Chemistry, 2003, 278(20): 17601-17608.

[2] Easey A. Synthetic Biology Methods to Optimise T4 RNA Ligase Activities[D]. University of East Anglia, 2018.

[3] Viollet S, Fuchs R T, Munafo D B, et al. T4 RNA ligase 2 truncated active site mutants: improved tools for RNA analysis[J]. BMC biotechnology, 2011, 11: 1-14.

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