PBCV DNA Ligase(SplintR连接酶)：适用于原位测序、高灵敏RNA检测
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2024-05-14
在分子生物学前沿，空间转录组学正以前所未有的分辨率，将生命活动从“基因表达谱”的抽象数据，还原为组织微环境中一幅幅生动的“分子解剖图”，极大地推动了基础科研与临床诊断的范式变革。然而，这一飞跃性进展始终绕不开一个根本性的技术挑战：如何将细胞内虚无缥缈的RNA转录本，原位、特异且高效地转化为可供仪器捕获与解读的物理信号。翌圣生物PBCV DNA Ligase（亦称为SplintR连接酶），正是一款为解决此挑战而生的革命性工具。
PBCV DNA Ligase 是一种 ATP 依赖的 DNA 连接酶，它能高效催化一个关键反应：当两条相邻的 DNA 单链（分别提供 3'-OH 的受体链和提供 5'-PO₄的供体链）通过一条完全互补的 RNA 链作为 “分子夹板” 对齐时，该酶可精准催化二者间磷酸二酯键的形成，实现靶向核酸的特异性连接（图 1）。这一独特的 RNA 指导 DNA 连接机制，如同为 RNA 转录本打造了专属 “信号转换器”，让原本难以捕捉的分子信息，转化为稳定可检测的物理信号，为空间转录组学的原位信号捕获提供了核心技术支撑。
PBCV DNA Ligase在原位测序中的应用解析
空间转录组学的崛起，实现了在保留组织空间结构完整性的前提下，精准解析基因表达的空间定位信息。为更清晰地梳理相关技术路径，以下将空间转录组学主要方法分为两类：
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分类 |
相关技术 |
描述 |
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基于NGS技术 |
10x Visium、Slide-seq、HDST、DBiT-seq、Stereo-seq等技术 |
通过收集空间条形码 RNA 进行测序分析 |
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基于成像原理 |
原位测序（ISS）（如ISS、FISSEQ、STARmap、EXseq和Mip-seq等技术） |
在组织样本中原位完成转录本的扩增与测序 |
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原位杂交（ISH）（如smFISH、seqFISH、MERFISH等技术） |
利用成像探针在组织中进行连续杂交检测 |
其中，原位测序（ISS）作为该领域的核心技术，更是达成单细胞分辨率基因分析的关键手段。这类技术通过探针与目标 mRNA 特异性杂交，借助滚环扩增（RCA）实现信号放大，最终通过荧光标记完成序列识别，完美保留基因表达的空间分布特征。
接下来，小编将以 Mip-seq 技术为例，详细解析 PBCV DNA Ligase 在原位测序中的核心作用机制，帮助大家理解其作用。
Mip-Seq 技术通过 PBCV DNA Ligase 介导的连接反应构建 RCA 模板，结合多轮测序实现高通量检测，能够以亚细胞分辨率精准解析 DNA、RNA、蛋白质及小分子等多种生物分子，在肿瘤基因突变检测、亲本基因等位基因特异性表达分析等场景中发挥重要作用，为精确肿瘤诊断提供技术支持。
MiP-Seq技术路线如下
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探针杂交：特异性挂锁探针和携带 RCA 启动子引物与目标 RNA 结合，为后续反应奠定基础；
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环状模板构建：PBCV DNA Ligase 高效连接挂锁探针形成环状 RCA 模板，为信号放大提供核心载体；
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原位扩增与测序：在 phi29 DNA聚合酶作用下完成 RCA 扩增，经多轮测序与信号解码，实现 DNA、RNA、蛋白质等多生物分子的亚细胞分辨率解析。
图2. Mip-seq原理图原理图[1]
除了上述应用，PBCV DNA Ligase也被可应用于EXTRA-CRISPR技术[3]（用于Cas12介导的高灵敏度miRNA检测）以及SELECT技术[4]（一种基于单碱基延伸和连接的qPCR扩增方法）等。在EXTRA-CRISPR技术中，该酶通过连接形成RCA模板，为随后的RCA扩增和信号增强提供了基础，显著提升了Cas12系统对miRNA的检测敏感性。而SELECT方法则是借助m6A修饰可阻止PBCV DNA Ligase连接两个寡核苷酸的特性，在经过几轮m6A选择后，含m6A的RNA模板产生的连接产物显著少于未修饰的RNA模板，接着通过qPCR可进行精确定量分析。这些应用实例充分展示了PBCV DNA Ligase原位测序、RNA检测等方面的广阔应用潜力。我司PBCV DNA Ligase在核心性能指标上展现出卓越且稳定的表现，为上述应用提供可靠的技术保障。
翌圣PBCV DNA Ligase数据展示
连接效率高
在25℃条件下，分别添加0.5 U、10 U和25 U剂量的翌圣（Cat#14962ES）与进口品牌A*的PBCV DNA ligase，反应60分钟以连接底物。琼脂糖凝胶电泳结果显示，翌圣PBCV DNA ligase与进口品牌A*的底物连接效果一致。
图3. PBCV DNA ligase连接效果验证
核酸外切酶、内切酶、RNase、磷酸酶残留低
将3个批次的翌圣PBCV DNA Ligase (Cat#14962ES)与底物DNA在37℃孵育4 h（125 U投入量），以及与底物RNA在37℃孵育16 h（25 U投入量）。琼脂糖凝胶电泳检测结果表明，翌圣PBCV DNA Ligase无核酸外切酶、切口酶、RNase残留。同时，利用磷酸酶检测盒对3个批次的PBCV DNA Ligase进行检测，4 h反应后，酶活(µmol/min)数据显示翌圣PBCV DNA Ligase磷酸酶残留极低（<0.0001）。
图4. 核酸外切酶、内切酶、RNase、磷酸酶残留检测
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产品应用 |
产品定位 |
产品名称 |
产品货号 |
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原位测序 |
5'端磷酸化挂锁探针 |
12902ES |
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挂锁探针连接（形成RCA模板） |
14962ES |
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RCA扩增（目标DNA放大） |
14404ES |
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多轮测序连接 |
14966ES |
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成像（以防止RNA在成像过程中发生降解） |
14675ES |
参考文献
[1] Phillips, E.A., Silverman, A.D., Joneja, A.et al. Detection of viral RNAs at ambient temperature via reporter proteins produced through the target-splinted ligation of DNA probes. Nat. Biomed. Eng (2023).
[2] Yan H, Wen Y, Tian Z, Hart N, Han S, Hughes SJ, Zeng Y. A one-pot isothermal Cas12-based assay for the sensitive detection of microRNAs. Nat Biomed Eng. 2023 Dec;7(12):1583-1601.
[3] Yu,Xiao,Ye,et al.An Elongation and Ligation-Based qPCR Amplification Method for the Radiolabeling-Free Detection of locus-specific N6-methyladenosine modifications.[J].Angewandte Chemie, 2018.
