蛋白纯化是将目标蛋白从实验样本的总蛋白中分离出来,同时仍保留目的蛋白的生物学活性及化学完整性。在构建载体阶段,除了一些必要的表达元件,还需要考虑密码子优化以及标签的选择。选择合适的标签不但有利于蛋白的纯化,促进蛋白的可溶性,同时也不能影响蛋白的结构功能和下游应用。以下简单列举几个常见蛋白标签:
表1. 不同蛋白纯化标签介绍
标签 |
大小 kDa |
序列 |
纯度 |
增溶性 |
标签去除 |
标签切割酶 |
His |
~0.84 |
HHHHHH |
+ |
+ |
不需要 |
TEV蛋白酶 |
GST |
26 |
由211个氨基酸组成 |
++ |
++ |
需要 |
3C蛋白酶/PSP |
MBP |
42 |
由大肠杆菌K12的malE基因编码 |
++ |
++ |
需要 |
Factor Xa、EK |
Strep(Ⅱ) |
1.06 |
Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys |
++++ |
+ |
不需要 |
/ |
Flag |
1.01 |
DYKDDDDK |
++++ |
+ |
不需要 |
EK |
His-Tag 为何会逐渐成为分离纯化蛋白质等生物工程产品最有效的技术之一。其主要优势在于:
序列兼容性高:N-端的His-tag与细菌的转录翻译机制兼容,有利于蛋白表达;
序列小影响小:His-tag非常小,His-tag对目的蛋白本身特性几乎没有影响,不会改变目的蛋白本身的可溶性和生物学功能;且在融合蛋白结晶后对蛋白的结构也没有影响;
免疫原性低:His-tag的免疫原性相对较低,可将纯化的蛋白直接注射入动物体内进行免疫并制备抗体;
联合使用性强:与其他的亲和标签构建成联合标签,可用于多种表达系统,纯化的条件温和;
适用范围广:His标签融合蛋白的适用范围也较广,即可用在非离子型表面活性剂存在的条件下纯化,也可以在变性条件下进行纯化。前者通常用来纯化疏水性强的目的蛋白,而后者通常纯化包涵体蛋白。
因此,His逐渐成为了蛋白纯化的首选标签。
HisSep Ni-NTA Agarose Resin以高度交联的琼脂糖凝胶为基质,通过化学方法偶联四配位的氮川三乙酸(NTA)为配体,螯合镍离子(Ni2+)后,形成非常稳定的八面体结构,镍离子处于八面体的中心,这样的结构可保护镍离子免受小分子的进攻,与Ni-IDA树脂相比,更加稳定,可以耐受一定浓度的还原剂、变性剂或耦合剂等苛刻条件,与Ni-TED树脂相比,目标蛋白吸附量更大。已经成为实验室纯化His标签蛋白不可或缺的树脂之一。
图1. His树脂的产品原理图
表2.不同配体所构成树脂的性能比较
配体 |
Ni-NTA |
Ni-IDA |
Ni-TED |
基质 |
琼脂糖凝胶 |
有机硅树脂 |
琼脂糖凝胶 |
Ni2+与His tag结合位数目 |
2 |
3 |
1 |
Ni2+与螯合物结合位数目 |
4 |
3 |
5 |
螯合物密度 |
最高 |
最低 |
介于前面两者之间 |
结合能力 |
≤50 mg/mL |
≤20 mg/mL |
≤10 mg/mL |
产品特性 |
对于His-Tag 蛋白具有高度专一性结合 |
||
蛋白结合能力最强, 载量最高 |
蛋白结合能力高于TED,低于NTA |
蛋白结合能力最低 |
|
耐受一定浓度的还原剂、变性剂或耦合剂等苛刻条件 |
易受其他小分子的进攻,破坏稳定结构 |
耐受能力最强,可以在含有高浓度的EDTA及DTT等苛刻条件下进行蛋白纯化 |
产品货号 |
20502ES |
20503ES |
20504ES/20505ES |
20561ES |
20497ES |
20498ES |
英文名称 |
HisSep Ni-NTA Agarose Resin |
HisSep Ni-NTA Agarose Resin 6FF |
HisSep Ni-NTA 6FF Chromatography Column, 5 mL / 1 mL |
HisSep Ni-NTA MagBeads |
Ni-TED Agarose Resin 6FF |
Ni-TED 6FF Chromatography Column, 5 mL |
中文名称 |
His标签蛋白琼脂糖纯化树脂 |
His标签蛋白琼脂糖高速纯化树脂 |
His标签蛋白纯化预装柱 5 mL/1 mL |
His标签蛋白纯化磁珠 |
His标签蛋白琼脂糖高速纯化树脂 |
His标签蛋白纯化预装柱 5 mL |
基质 |
交联的6% 琼脂糖凝胶 |
高度交联的6%琼脂糖凝胶 |
磁性琼脂糖微球 |
高度交联的6%琼脂糖凝胶 |
||
耐压 |
0.1 MPa, 1 bar |
0.3 MPa, 3 bar |
0.3 MPa, 3 bar |
N/A |
0.3 MPa, 3 bar |
0.3 MPa, 3 bar |
纯化建议 |
基质的耐压一般,适合孵育法、重力柱小量纯化 |
基质的耐压性高,搭配蛋白纯化仪可以用于工业大规模蛋白的纯化 |
通过磁性分离快速便捷地进行蛋白纯化 |
基质的耐压性高,搭配蛋白纯化仪可以用于工业大规模蛋白的纯化 |
||
配体 |
Ni-NTA |
Ni-NTA |
Ni-TED |
|||
载量 |
>40 mg 6×His-tagged protein/mL基质 |
> 40 mg 6×His-tagged protein/mL磁珠 |
>15 mg His-tagged protein(27.5 KD)/mL基质 |
|||
耐受性 |
8 M urea、6 M 盐酸、0.5-1 mM DTT、1 mM EDTA等 |
24 h耐受10 mM EDTA、5 mM DTT、1 M NaOH、6 M 盐酸胍 ;2 h耐受500 mM咪唑,100 mM EDTA |
||||
应用 |
His标签蛋白纯化首选,载量高,耐受性一般,特别适用于原核表达纯化体系 |
载量稍低,耐受性超强,特别适用于真核表达纯化体系 |
附:HisSep Ni-NTA MagBeads(Cat#20561ES)产品特点
1、与传统预装柱和树脂相比,无需多次离心样本和控制上样流速,极大的缩短纯化时间。
2、 一步纯化即可得到高达95%以上纯度的目标蛋白
3、目标蛋白产率高:产率可达到70~80%
4、可重复使用多达5次
5、可轻松调节目标蛋白浓度和体积
6、蛋白损失小,且不存在蛋白变性、沉淀的风险
测试产品:
1、某知名品牌His纯化产品;
2、大量生产的FF高流速产品;
3、小样生产的FF高流速产品;
4、本次生产的普通级别的His树脂(20502ES);
缓冲液:各个处理组均为1 mL树脂纯化200 mL菌液;洗杂使用25 mM的咪唑,洗脱液为250 mM的咪唑。
测试报告一:His纯化树脂结合效率测试,与市场知名品牌进行对比,Yeasen研发的20502ES HisSep Ni-NTA Agarose Resin (4号)具有良好的结合效率。如下图:
图2. His纯化树脂结合效率测试
测试报告二:以常利用的变性剂尿素为例,分别进行了不同产品在8M尿素下耐受性测试, 20502ESHisSep Ni-NTA Agarose Resin (4号)对尿素的耐受良好,与市场知名品牌无差异。如下图:
图3. His树脂对8M尿素耐受性测试
测试报告三:对于20502ES HisSep Ni-NTA Agarose Resin(4号)进行了批次检测稳定性测试,从结果看批次间差异基本控制在5%以内,以保证更好的稳定性。如下图:
图4. His纯化树脂的批次间比较
常见问题 |
原因 |
优化建议 |
洗脱组分中无目的蛋白 |
蛋白可能是包涵体,没在上清中 |
可以通过电泳检测裂解液,分析上清中是否含有目的蛋白,包涵体蛋白需按照包涵体蛋白的纯化方式 |
表达量太低 |
优化表达条件。 |
|
目的蛋白结合比较弱,在洗杂步骤中已被洗下来 |
提高Wash Buffer的pH值,或者降低咪唑浓度 |
|
目的蛋白结合过强,不容易洗脱下来 |
降低Elution Buffer的pH值,或者增加Elution Buffer中咪唑浓度。 |
|
使用10-100 mM EDTA剥离镍离子,同时得到目的蛋白 |
||
洗脱组分不纯(含多种蛋白)
|
洗杂操作不彻底 |
增加Wash Buffer体积 |
样品中含有其他His标签蛋白 |
通过调节pH值或咪唑浓度来优化洗杂条件。再使用其他纯化手段(如去离子交换、疏水等)进一步纯化洗脱组分 |
产品名称 |
货号 |
规格 |
目录价/元 |
HisSep Ni-NTA Agarose Resin His标签蛋白琼脂糖纯化树脂 |
10 mL /50 mL/ 100 mL/ 2x500 mL |
678/2848/5328/42686 |
|
HisSep Ni-NTA Agarose Resin 6FF His标签蛋白琼脂糖高速纯化树脂 |
10 mL /50 mL/ 100 mL/ 1000 mL |
798/3358/5838/44686 |
|
HisSep Ni-NTA 6FF Chromatography Column, 5 mL His标签蛋白纯化预装柱, 5 mL |
5 mL/ 5x5 mL |
728/2938 |
|
HisSep Ni-NTA 6FF Chromatography Column, 1 mL His标签蛋白纯化预装柱, 1 mL |
1 mL/ 5x1 mL |
298/1048 |
|
HisSep Ni-NTA MagBeads His标签蛋白纯化磁珠 |
1 mL /5 mL/ 25 mL/100 mL |
275/825/1995/7095 |
|
Ni-TED Agarose Resin 6FF His标签蛋白琼脂糖高速纯化树脂 |
10 mL /50 mL/ 100 mL/500 mL |
795/3355/5565/17665 |
|
Ni-TED 6FF Chromatography Column, 5 mL His标签蛋白纯化预装柱5 mL |
5 mL/ 5x5 mL |
728/2938 |
产品名称 |
货号 |
规格 |
目录价/元 |
Anti-His Affinity Gel Anti-His标签亲和纯化凝胶 |
1 mL /5 mL/ 25 mL/100 mL |
4354/13756/ 62786/189756 |
|
Imidazole咪唑 |
100 g/500 g |
223/553 |
经典文章分享:一文书纸,教您如何使用树脂和预装柱纯化产品!