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靶标伴“His”,蛋白纯化明明白白!

 
 
蛋白纯化简介

 

蛋白纯化是将目标蛋白从实验样本的总蛋白中分离出来,同时仍保留目的蛋白的生物学活性及化学完整性。在构建载体阶段,除了一些必要的表达元件,还需要考虑密码子优化以及标签的选择。选择合适的标签不但有利于蛋白的纯化,促进蛋白的可溶性,同时也不能影响蛋白的结构功能和下游应用。以下简单列举几个常见蛋白标签:

 

表1. 不同蛋白纯化标签介绍

 

标签

大小 kDa

序列

纯度

增溶性

标签去除

标签切割酶

His

~0.84

HHHHHH

+

+

不需要

TEV蛋白酶

GST

26

211个氨基酸组成

++

++

需要

3C蛋白酶/PSP

MBP

42

由大肠杆菌K12的malE基因编码

++

++

需要

Factor Xa、EK

Strep(Ⅱ)

1.06

Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys

++++

+

不需要

/

Flag

1.01

DYKDDDDK

++++

+

不需要

EK

 

 

 
 
浓缩的精华,纯化的领头羊

His-Tag 为何会逐渐成为分离纯化蛋白质等生物工程产品最有效的技术之一。其主要优势在于:

 

序列兼容性高:N-端的His-tag与细菌的转录翻译机制兼容,有利于蛋白表达;

序列小影响小:His-tag非常小,His-tag对目的蛋白本身特性几乎没有影响,不会改变目的蛋白本身的可溶性和生物学功能;且在融合蛋白结晶后对蛋白的结构也没有影响;

免疫原性低:His-tag的免疫原性相对较低,可将纯化的蛋白直接注射入动物体内进行免疫并制备抗体;

联合使用性强:与其他的亲和标签构建成联合标签,可用于多种表达系统,纯化的条件温和;

适用范围广:His标签融合蛋白的适用范围也较广,即可用在非离子型表面活性剂存在的条件下纯化,也可以在变性条件下进行纯化。前者通常用来纯化疏水性强的目的蛋白,而后者通常纯化包涵体蛋白。

因此,His逐渐成为了蛋白纯化的首选标签。

 

 

 
 
His纯化树脂生产工艺

HisSep Ni-NTA Agarose Resin以高度交联的琼脂糖凝胶为基质,通过化学方法偶联四配位的氮川三乙酸(NTA)为配体,螯合镍离子(Ni2+)后,形成非常稳定的八面体结构,镍离子处于八面体的中心,这样的结构可保护镍离子免受小分子的进攻,与Ni-IDA树脂相比,更加稳定,可以耐受一定浓度的还原剂、变性剂或耦合剂等苛刻条件,与Ni-TED树脂相比,目标蛋白吸附量更大。已经成为实验室纯化His标签蛋白不可或缺的树脂之一。

 

图1. His树脂的产品原理图

 

表2.不同配体所构成树脂的性能比较

配体

Ni-NTA

Ni-IDA

Ni-TED

基质

琼脂糖凝胶

有机硅树脂

琼脂糖凝胶

Ni2+His tag结合位数目

2

3

1

Ni2+与螯合物结合位数目

4

3

5

螯合物密度

最高

最低

介于前面两者之间

结合能力

≤50 mg/mL

≤20 mg/mL

≤10 mg/mL

产品特性

对于His-Tag 蛋白具有高度专一性结合

蛋白结合能力最强,

载量

蛋白结合能力高于TED低于NTA

蛋白结合能力最低

耐受一定浓度的还原剂、变性剂或耦合剂等苛刻条件

易受其他小分子的进攻,破坏稳定结构

耐受能力最强,可以在含有高浓度的EDTA及DTT等苛刻条件下进行蛋白纯化

 

 
 
翌圣His纯化产品选购指南

 

产品货号

20502ES

20503ES

20504ES/20505ES

20561ES

20497ES

20498ES

英文名称

HisSep Ni-NTA Agarose Resin

HisSep Ni-NTA Agarose Resin 6FF

HisSep Ni-NTA 6FF Chromatography Column,

5 mL / 1 mL

HisSep Ni-NTA MagBeads

Ni-TED Agarose Resin 6FF

Ni-TED 6FF Chromatography Column,

5 mL

中文名称

His标签蛋白琼脂糖纯化树脂

His标签蛋白琼脂糖高速纯化树脂

His标签蛋白纯化预装柱

5 mL/1 mL

His标签蛋白纯化磁珠

His标签蛋白琼脂糖高速纯化树脂

His标签蛋白纯化预装柱

5 mL

基质

交联的6%

琼脂糖凝胶

高度交联的6%琼脂糖凝胶

磁性琼脂糖微球

高度交联的6%琼脂糖凝胶

耐压

0.1 MPa, 1 bar

0.3 MPa, 3 bar

0.3 MPa, 3 bar

N/A

0.3 MPa, 3 bar

0.3 MPa, 3 bar

纯化建议

基质的耐压一般,适合孵育法、重力柱小量纯化

基质的耐压性高,搭配蛋白纯化仪可以用于工业大规模蛋白的纯化

通过磁性分离快速便捷地进行蛋白纯化

基质的耐压性搭配蛋白纯化仪可以用于工业大规模蛋白的纯化

配体

Ni-NTA

Ni-NTA

Ni-TED

载量

40 mg 6×His-tagged protein/mL基质

> 40 mg 6×His-tagged protein/mL磁珠

>15 mg His-tagged protein(27.5 KD)/mL基质

耐受性

8 M urea、6 M 盐酸、0.5-1 mM DTT、1 mM EDTA等

24 h耐受10 mM EDTA5 mM DTT1 M NaOH6 M 盐酸胍 ;2 h耐受500 mM咪唑,100 mM EDTA

应用

His标签蛋白纯化首选,载量高,耐受性一般,特别适用于原核表达纯化体系

载量稍低,耐受性超强,特别适用于真核表达纯化体系

 

附:HisSep Ni-NTA MagBeads(Cat#20561ES)产品特点

1、与传统预装柱和树脂相比,无需多次离心样本和控制上样流速,极大的缩短纯化时间。

2、 一步纯化即可得到高达95%以上纯度的目标蛋白

3、目标蛋白产率高:产率可达到70~80%

4、可重复使用多达5次   

5、可轻松调节目标蛋白浓度和体积 

6、蛋白损失小,且不存在蛋白变性、沉淀的风险

 

 
 
产品性能

测试产品:

1、某知名品牌His纯化产品;

2、大量生产的FF高流速产品;

3、小样生产的FF高流速产品;

4、本次生产的普通级别的His树脂(20502ES);

缓冲液:各个处理组均为1 mL树脂纯化200 mL菌液;洗杂使用25 mM的咪唑,洗脱液为250 mM的咪唑。

测试报告一:His纯化树脂结合效率测试,与市场知名品牌进行对比,Yeasen研发的20502ES  HisSep Ni-NTA Agarose Resin (4号)具有良好的结合效率。如下图


图2. His纯化树脂结合效率测试

 

测试报告二:以常利用的变性剂尿素为例,分别进行了不同产品在8M尿素下耐受性测试, 20502ESHisSep Ni-NTA Agarose Resin (4号)对尿素的耐受良好,与市场知名品牌无差异。如下图:


图3. His树脂对8M尿素耐受性测试

 

测试报告三:对于20502ES  HisSep Ni-NTA Agarose Resin(4号)进行了批次检测稳定性测试,从结果看批次间差异基本控制在5%以内,以保证更好的稳定性。如下图:


图4. His纯化树脂的批次间比较

 

 
 
FAQ

常见问题

原因

优化建议

洗脱组分中无目的蛋白

蛋白可能是包涵体,没在上清中

可以通过电泳检测裂解液,分析上清中是否含有目的蛋白,包涵体蛋白需按照包涵体蛋白的纯化方式

表达量太低

优化表达条件。

目的蛋白结合比较弱,在洗杂步骤中已被洗下来

提高Wash Buffer的pH值,或者降低咪唑浓度

目的蛋白结合过强,不容易洗脱下来

降低Elution BufferpH值,或者增加Elution Buffer中咪唑浓度。

使用10-100 mM EDTA剥离镍离子,同时得到目的蛋白

洗脱组分不纯(含多种蛋白)

 

洗杂操作不彻底

增加Wash Buffer体积

样品中含有其他His标签蛋白

通过调节pH值或咪唑浓度来优化洗杂条件。再使用其他纯化手段(如去离子交换、疏水等)进一步纯化洗脱组分

 

 

 
 
产品信息
 

产品名称

货号

规格

目录价/元

HisSep Ni-NTA Agarose Resin

His标签蛋白琼脂糖纯化树脂

20502ES10/50/60/80

10 mL /50 mL/

100 mL/

2x500 mL

678/2848/5328/42686

HisSep Ni-NTA Agarose Resin 6FF

His标签蛋白琼脂糖高速纯化树脂

20503ES10/50/60/80

10 mL /50 mL/

100 mL/

1000 mL

798/3358/5838/44686

HisSep Ni-NTA 6FF Chromatography Column, 5 mL

His标签蛋白纯化预装柱, 5 mL

20504ES08/25

5 mL/

5x5 mL

728/2938

HisSep Ni-NTA 6FF Chromatography Column, 1 mL

His标签蛋白纯化预装柱, 1 mL

20505ES03/08

1 mL/

5x1 mL

298/1048

HisSep Ni-NTA MagBeads

His标签蛋白纯化磁珠

20561ES03/08/25/60

1 mL /5 mL/

25 mL/100 mL

275/825/1995/7095

Ni-TED Agarose Resin 6FF

His标签蛋白琼脂糖高速纯化树脂

20497ES10/50/60/76

10 mL /50 mL/

100 mL/500 mL

795/3355/5565/17665

Ni-TED 6FF Chromatography Column, 5 mL

His标签蛋白纯化预装柱5 mL

20498ES08/25

5 mL/

5x5 mL

728/2938

 

 

 
 
相关产品订购

 

产品名称

货号

规格

目录价/元

Anti-His Affinity Gel

Anti-His标签亲和纯化凝胶

20589ES03/

08/25/60

1 mL /5 mL/

25 mL/100 mL

4354/13756/

62786/189756

Imidazole咪唑

20501ES60

/76

100 g/500 g

223/553

 

 

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