Anti-Flag亲和纯化凝胶产品升级-flag标签蛋白纯化更高效
Anti-Flag亲和纯化凝胶（20584ES）由高质量的鼠源IgG2b单克隆抗体与4%高度交联的琼脂糖凝胶通过供价偶联制备，本产品具有较高的Flag标签融合蛋白加载容量（至少为1.1 mg protein/mL凝胶），杂蛋白非特异结合少，可用于带有Flag标签的融合蛋白免疫沉淀（IP）和纯化。
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高特异性：选用高质量的鼠源IgG2b单克隆抗体，能够特异性吸附Flag蛋白序列。 -
高收率，高纯度：得到高纯度的Flag标签蛋白 -
高结合载量：载量≥1.1mg蛋白/mL凝胶 -
结合蛋白类型多：Met-FLAG-Protein，N端FLAG-Protein，C端FLAG-Protein -
用途广泛：可用于蛋白质纯化或COIP
翌圣目前拥有2种Anti-Flag亲和纯化凝胶，各具特色，能够完全满足用户flag标签蛋白纯化的应用需求。
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名称 |
Anti-DYKDDDDK (Flag) Affinity Gel(Anti-Flag亲和纯化凝胶) |
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货号 |
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基质 |
4%高度交联的琼脂糖 |
4%的琼脂糖 |
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配基 |
1A3 |
1.00E+06 |
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蛋白结合 |
≥1.1 mg蛋白/mL凝胶 |
≥1.1 mg蛋白/mL凝胶 |
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应用 |
蛋白纯化,免疫沉淀(IP) |
蛋白纯化,免疫沉淀(IP) |
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选择指南 |
更适合碱洗脱和酸洗脱 |
更适合多肽况争洗脱和酸洗 |
1.Anti-Flag亲和纯化凝胶(20584ES)纯化原核表达的Met修饰的N端Flag融合蛋白，N端Flag融合蛋白，C端Flag融合蛋白。
图1.Yeasen Anti-Flag亲和纯化凝胶纯化结果跑胶图
a：Flag-N b：Flag-M c：Flag-C
M：蛋白Marker;1：发酵菌破碎上清原液；2：发酵菌破碎上清柱后穿透；3：洗脱（pH2.7洗脱1）；4：洗脱（pH2.7洗脱2）；5：洗脱（pH2.7洗脱3）；6：洗脱（pH2.7洗脱4）；7：纯化后凝胶（pH2.7洗脱）；8：洗脱（pH12洗脱1）；9：洗脱（pH12洗脱2）；10：洗脱（pH12洗脱3）；11：洗脱（pH12洗脱4）；12：纯化后凝胶（pH12洗脱）
2.Anti-Flag亲和纯化凝胶(20584ES)变性剂兼容性测试，在下表中测试耐受浓度以内对纯化几乎无影响。
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试剂 |
测试耐受浓度 |
注解 |
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EDTA |
5 mM |
螯合剂浓度越高，纯化效率越低，目标蛋白回收率越低。 |
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β-巯基乙醇 |
100 mM |
还原剂将破坏填料上抗体中的二硫键。在纯化过程中避免使用还原剂或保持低浓度(<10mM)。当还原剂达到此处提到的最大耐受浓度时，SDS-PAGE分析中将出现抗体重链条带(~50 kDa)。如果样品中含有高浓度的还原试剂，则填料不能重复使用。 |
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DTT |
80 mM |
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Tween 20 |
5% |
洗涤剂的浓度不得超过5%。 |
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Triton X-100 |
5% |
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盐酸胍 |
0.3 M |
离液剂将使DYKDDDDK-标记的靶蛋白变性。不超过0.3 M盐酸或1.5 M尿素。 |
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尿素 |
1.5 M |
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NaCl |
0.5 M |
浓度越高，纯化效率越低，目标蛋白回收率越低。 |
3.翌圣Anti-Flag亲和纯化凝胶(20584ES)与国外进口品牌S*纯化对比测试。
图2.Yeasen（a) PK进口品牌S*(b)Anti-Flag凝胶对比测试跑胶图
M：蛋白Marker；1：Flag-N蛋白柱前原液；2：Flag-N蛋白柱后穿透；3：洗脱（pH2.7洗脱）；4：洗脱（pH12洗脱）；5：洗脱（0.1 mg/ml 3×Flag多肽洗脱）；6：洗脱（0.5 mg/ml 3×Flag多肽洗脱）
图3.Yeasen（a) PK进口品牌S*(b)Anti-Flag凝胶每ml凝胶纯化蛋白得率对比测试结果
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问题 |
可能原因 |
推荐解决方案 |
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柱子反压过高 |
填料被堵塞 |
清洗树脂。 |
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裂解液中含有微小的固体颗粒，建议上样前最好用0.22μm或0.45μm滤膜过滤，或离心去除。 |
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样品太粘稠 |
样品中含高浓度的核酸，延长破碎时间直至粘度降低，或添加DNaseI（终浓度为5μg/ml），Mg2+（终浓度1mM），冰上孵育10-15min |
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缓冲液太粘稠 |
有机试剂或蛋白稳定试剂（如甘油等）可能会引起反压增高，降低操作流速。 |
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洗脱组分中无目的蛋白 |
Flag标签蛋白变性了 |
过度的裂解使目的蛋白变性使用温和的裂解条件，实验条件以经验为准。 |
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洗脱方式不合适 |
优先选择酸洗或碱洗 |
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目的蛋白聚集产生沉淀 |
在细胞裂解前溶液中加入DTT，终浓度为1-10mM |
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融合蛋白改变了Flag的构象，影响了目的蛋白的结合力 |
测定pGEX中Flag的结合力，对载体进行超声处理，检测其结合力。如果载体中Flag有很高的亲和力，有可能是改变融合蛋白的构象从而降低了Flag标签蛋白的亲和力。 |
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降低结合温度至4℃，充分清洗。 |
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目的蛋白没有完全洗脱下来 |
洗脱体积太少 |
增加洗脱液体积，减小洗脱流速。 |
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洗脱液中Gly-HCl的pH发生改变 |
使用新鲜配制的洗脱液 |
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洗脱液孵育时间不够 |
增加洗脱液与凝胶的孵育时间 |
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电泳或western blot检测中发现多条带 |
Flag融合蛋白已经发生降解 |
在裂解液中加入蛋白酶抑制剂，如加入1 mM PMSF |
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可能是蛋白酶对目的蛋白部分降解造成的，可使用蛋白酶缺陷型宿主菌（如lon-或ompT） |
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细胞破碎过度 |
减少细胞破碎时间，超声前加入溶菌酶（菌液体积的0.1倍10mg/ml溶菌酶，25mM Tris-HCl，pH8.0），避免发泡导致蛋白酶变性，过度超声破碎增加宿主内源蛋白与Flag融合后的蛋白的共纯化。 |
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抗体与E. coli的各种蛋白反应 |
抗体吸附E.coli蛋白：Flag-抗体；超声处理去除Flag抗体，可以用于Western Blot检测 |
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产品名称 |
产品编号 |
规格(mL) |
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20584ES03/08/25/60 |
1/5/25/100 |
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20585ES03/08/25/60 |
1/5/25/100 |
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20586ES03/08/25/60 |
1/5/25/100 |
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20587ES03/08/25/60 |
1/5/25/100 |
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20588ES03/08/25/60 |
1/5/25/100 |
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20589ES03/08/25/60 |
1/5/25/100 |
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20564ES03/08 |
1/5 |
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20565ES03/08 |
1/5 |
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20566ES03/08 |
1/5 |
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20567ES03/08 |
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