Hieff^® Fast T4 DNA Ligase是一款可用于NGS建库过程中DNA片段和接头连接的单酶产品，该产品已经过高通量测序验证，质量优异。本酶具有高效的连接能力，非常适合复杂结构核酸片段的连接，比如华大平台的Ω接头。对于无需进行体系调整的客户，推荐选购Hieff NGS^® Ultima DNA Ligation Module (Cat#12604)，其核心组分即为本品。
 

产品组分

组分编号	组分名称	产品编号/规格
		10299ES40 （40000 U）	10299ES42 （400000 U）	10299ES83 （1600 KU）	10299ES08 （5 mL）
10299-A	Hieff® Fast T4 DNA Ligase (400 U/µL)	100 µL	1 mL	4 mL	5 mL
10299-B	10 × T4 DNA Ligase Buffer	250 μL	5 × 500 μL	10 mL	12.5 mL

单位定义

在20 μL的连接反应体系中，6 μg的λDNA-Hind Ⅲ分解物在16℃下反应30 min时，催化50%以上的DNA片段发生连接所需要的酶量定义为1个活性单位(U)。

运输与保存方法

冰袋运输。-20℃保存，有效期2年。

注意事项

1. T4 DNA Ligase对物理变性敏感，混合时轻轻颠倒试管摇匀，请勿剧烈振荡；

2. 酶使用时宜存放在冰盒内或冰浴上，使用完毕后宜立即放置于-20℃保存；

3. 本产品仅做科研用途；

4. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

 

使用方法

1. 目前主流的合并法DNA建库试剂盒，其末端修复和加A处理后一般不纯化，直接进行接头连接。本试剂盒可与主流的商业化末端修复加A体系兼容，进行接头连接。反应体系请参考如下配制，涡旋瞬离后置于20℃，反应15 min即可。

表1  Adapter Ligation体系

名称	体积（μL）
dA-tailed DNA	60
10 × T4 DNA Ligase Buffer	10
50% PEG 6000	10*
DNA Adapter	X**
Hieff® Fast T4 DNA Ligase (400 U/µL)	1-5***
ddH2O	To 100

【注】：*试剂盒内未提供50% PEG 6000，需自行准备。

**接头用量参考表2。

***Hieff^® Fast T4 DNA Ligase用量可根据需要添加1-5 μL。

2. Adapter的质量和使用浓度直接影响连接效率及文库产量。Adapter用量过高可能会产生较多Adapter Dimer；用量较低可能会影响连接效率及文库产量。表2列举了使用本试剂盒，不同Input DNA量推荐的Adapter使用量。

表2  500 pg-1 μg Input DNA推荐的Adapter使用浓度

Input DNA	Adapter : Input DNA摩尔比	Input DNA	Adapter : Input DNA摩尔比
1 μg	10:1	50 ng	100:1
500 ng	20:1	25 ng	200:1
250 ng	40:1	1 ng	200:1
100 ng	100:1	500 pg	400:1

【注】：Input DNA摩尔数（pmol）≈ Input DNA质量(ng)/ [0.66 × Input DNA平均长度（bp）]。

【接头添加计算举例】：当Input DNA为100 ng，Input DNA长度为300 bp时，接头应该添加多少？

第一步，计算Input DNA摩尔数。公式：Input DNA摩尔数（pmol）≈ Input DNA质量(ng)/ [0.66 × Input DNA平均长度（bp）]；

Input DNA摩尔数（pmol）=100 ÷（0.66×300）=0.5 pmol；

第二步，计算接头添加摩尔数。根据表2查询接头添加比例；

根据表2，查得Input DNA 100ng时接头添加比例100:1，则接头添加摩尔数=100×0.5 pmol=50 pmol；

第三步，计算接头添加体积。接头浓度=15 μmol/L（如使用其他接头，浓度需要依据其他接头浓度参数）；

接头添加体积=接头添加摩尔数（50 pmol）÷接头浓度（15 μmol/L）=3.34 μL（注：15 μmol/L=15 pmol/μL）

综上，接头可添加3.4 μL。（注：接头最大加入体积不超过5 μL）

HB220930