本产品是2×实时定量PCR扩增的预混合溶液。采用的抗体法热启动DNA聚合酶（Cat#10113），在预变性温度（95℃）加热30 sec，UNICON® Taq抗体失活，释放出Taq DNA Polymerase活性。抗体法热启动Taq酶可以有效抑制引物非特异性退火导致的扩增。同时，配方优化了有效抑制非特异性PCR扩增的因子和提升PCR反应扩增效率的因子，适合低浓度模板的扩增，使定量PCR可以在宽广的定量区域内获得良好的标准曲线。

Mix中含有Hieff® Taq DNA Polymerase、UNICON® Taq抗体、SYBR Green I、dNTPs、Mg²⁺。使用时，仅需在扩增体系中加入模板和引物即可进行实时荧光定量PCR，大大简化操作过程，降低污染几率。

• 特异性好

-25~-15℃避光保存，有效期18个月。本品避免反复冻融。

产品中含有荧光染料SYBR Green I，保存或配制反应体系时需避免强光照射。

Q：模板用量X 是多少？常用的量是多少？

A:(a)X 表示模板 DNA 量需要实验者在首次实验时进行摸索。首先对模板DNA 进行稀释（一般推荐 5-10 倍），然后模板量梯度上样，选择 CT 值落在  20-30  之间的最佳上样量。

(b)常用的量是逆转录 500-1000ng 总RNA，稀释 10 倍取 1μL cDNA 进行qPCR 实验。

Q：qPCR 实验结果的有效性？为什么建议Ct 值要大于 15？

A:(a)有效性要满足三个条件：（1）标准曲线：扩增效率范围:90-110%，对应斜率为-3--3.5。R2＞0.98。 (扩增效率=10-1/斜率-1)，当斜率=-3.32 时，扩增效率=100%。（2）扩增曲线：S 型曲线，且 Ct 值在 15－35 之间，阴性对照 Ct＞35 或无Ct 值。（3） 熔解曲线：为单一峰。

(b)3-15 个循环的荧光值标准差的 10 倍是荧光阈值，Ct 值太小了会影响曲线。

Q：Rox 的作用？

A:ROX 是一种参比染料，其作用是标准化荧光定量反应中的非PCR 震荡，校正加样误差或者是孔与孔之间的误差，提供一个稳定的基线。

Q：为什么扩增曲线不稳定（扩增曲线平台期锯齿状）？

A:可能原因：a）RNA 纯度低，体系中存在较多杂质；推荐参数：OD260/OD280=1.8-2.0， OD260/OD230＞2.0。随着 qPCR 反应的进行，阻碍反应的因素不断增加，若 RNA 纯度低，杂质多，会进一步影响仪器平台期的算法，导致出现锯齿状。b）仪器长时间未做校准。仪器未校准会使仪器算法错误，导致各种异常结果。

解决方案：a）先梯度加大模板稀释倍数看优化效果。若效果仍不好建议新制备高纯度RNA 重新实验。

b）定期（一般 1 年）进行仪器校准保养。

Q：为什么扩增曲线无法达到平台期？

A:可能原因：a）模板量太低（CT 值 35 左右）。推荐 Ct 值：15＜Ct＜30。原因：Ct 值太大（如  Ct＞30），刚进入指数扩增期几个循环就停止了反应，故无法到达平台期。 b）循环次数太少（30 cycles）；循环次数过少（如 35）导致刚进入指数扩增期几个循环就停止了反应，故无法到达平台期。c）试剂扩增效率低（CT 小，但无法达到平台期，曲线比较“趴”）。

解决方案：a）提高模板量；参考 Q1 的优化方法。b）提高循环次数；推荐循环数：一般 40。低丰度基因可设 45。c）做标准曲线测定扩增效率，若确实偏低，则换试剂。d）增加 Mg2+浓度（会增加非特异扩增）

Q：为什么出现双峰，并且较低峰 Tm 在 80℃之前？

A:较低峰 Tm 在 80℃之前可能原因：存在引物二聚体（一般mRNA 反转录后定量，产物在 100-150bp 左右，峰对应 Tm 值为 80-90℃。若有引物二聚体存在，引物二聚体大小只有几十bp，峰对应 Tm 值在 70-80℃之间。故会在 80℃以前出现一个峰， 80℃以后出现一个峰），模板浓度过低或引物浓度过高。

解决方案：a）适当提高退火温度； b）提高模板量，降低引物浓度； c）重新设计引物。

Q：为什么出现双峰，双峰 Tm 都在 80℃以前？

A:双峰Tm 都在 80℃以前的可能原因：做 MicroRNA 定量时存在引物二聚体。Micro RNA 反转录后定量， 产物在 80-90bp 左右，峰对应Tm 值为 70-80℃，若有引物二聚体存在，引物二聚体大小只有几十 bp，峰对应 Tm 值也在 70-80℃之间。故会在 80℃ 以前出现双峰。

优化方法：提高退火温度、降低引物浓度或重新设计引物等方式优化。

Q：为什么出现双峰，并且双峰Tm 都在 80℃以后？

A:可能原因：a）引物特异性过差导致非特异性产物扩增。b）交叉污染。c）gDNA 污染，可通过 NRC 进行确认。

解决方案：a）Blast 检查引物特异性，差则重新设计引物。b）超净台中操作，注意更换 Tip 头，避免交叉污染。c）通过 NRC 阴性对照进行确认，若有，需重新制备模板。

Q：为什么是单峰，但 Tm 在 80℃之前？

A:可能原因：扩增产物是完全的引物二聚体，可能是未加模板。

注：若 microRNA，则结果正常（做 microRNA 定量时存在引物二聚体。micro RNA 反转录后定量， 产物在 80-90bp 左右，峰对应 Tm 值为 70-80℃，若有引物二聚体存在，引物二聚体大小只有几十bp，峰对应 Tm 值也在 70-80℃之间。故会在 80℃以前出现双峰）。

解决方案：进行高分辨率琼脂糖电泳，检测有无目的条带，以确定模板是否加入。优化方法：新配制无误的反应体系，重新实验。

Q：为什么是单峰，但峰不尖锐？

A:可能原因：存在大小相近的非特异性扩增

解决方案：a）温度跨度不高于 7℃，视为可用结果（即 Tm 值跨度＜7℃可认为是同一种产物）；b）进行高浓度琼脂糖电泳（高分辨率），确认是否为单一条带。

[1] Sun X, Peng X, Cao Y, Zhou Y, Sun Y. ADNP promotes neural differentiation by modulating Wnt/β-catenin signaling. Nat Commun. 2020;11(1):2984. Published 2020 Jun 12. doi:10.1038/s41467-020-16799-0(IF:11.614)

[2] Lin S, Wen Z, Li S, et al. LncRNA Neat1 promotes the macrophage inflammatory response and acts as a therapeutic target in titanium particle-induced osteolysis. Acta Biomater. 2022;142:345-360. doi:10.1016/j.actbio.2022.02.007(IF:8.947)

[3] Chen K, Cai Y, Cheng C, et al. MYT1 attenuates neuroblastoma cell differentiation by interacting with the LSD1/CoREST complex. Oncogene. 2020;39(21):4212-4226. doi:10.1038/s41388-020-1268-6(IF:7.971)

[4] Zhao S, Xie T, Shen L, et al. An Immunological Perspective: What Happened to Pregnant Women After Recovering From COVID-19?. Front Immunol. 2021;12:631044. Published 2021 Feb 3. doi:10.3389/fimmu.2021.631044(IF:7.561)

[5] Lv Y, Wang X, Li X, et al. Nucleotide de novo synthesis increases breast cancer stemness and metastasis via cGMP-PKG-MAPK signaling pathway. PLoS Biol. 2020;18(11):e3000872. Published 2020 Nov 13. doi:10.1371/journal.pbio.3000872(IF:7.076)

[6] Zhao Q, Wu J, Cai G, et al. A novel quantitative trait locus on chromosome A9 controlling oleic acid content in Brassica napus. Plant Biotechnol J. 2019;17(12):2313-2324. doi:10.1111/pbi.13142(IF:6.840)

[7] Chen Z, Huang Y, Yu C, Liu Q, Qiu C, Wan G. Cochlear Sox2⁺ Glial Cells Are Potent Progenitors for Spiral Ganglion Neuron Reprogramming Induced by Small Molecules. Front Cell Dev Biol. 2021;9:728352. Published 2021 Sep 21. doi:10.3389/fcell.2021.728352(IF:6.684)

[8] Qiu J, Fu Y, Chen Z, et al. BTK Promotes Atherosclerosis by Regulating Oxidative Stress, Mitochondrial Injury, and ER Stress of Macrophages. Oxid Med Cell Longev. 2021;2021:9972413. Published 2021 May 27. doi:10.1155/2021/9972413(IF:6.543)

[9] Qiu J , Peng P , Xin M , et al. ZBTB20-mediated titanium particle-induced peri-implant osteolysis by promoting macrophage inflammatory responses. Biomater Sci. 2020;8(11):3147-3163. doi:10.1039/d0bm00147c(IF:6.183)

[10] He L, Fan X, Li Y, et al. Overexpression of zinc finger protein 384 (ZNF 384), a poor prognostic predictor, promotes cell growth by upregulating the expression of Cyclin D1 in Hepatocellular carcinoma. Cell Death Dis. 2019;10(6):444. Published 2019 Jun 5. doi:10.1038/s41419-019-1681-3(IF:5.959)

[11] Wu W, Zhang X, Zhou J, et al. Clemastine Ameliorates Perioperative Neurocognitive Disorder in Aged Mice Caused by Anesthesia and Surgery. Front Pharmacol. 2021;12:738590. Published 2021 Aug 23. doi:10.3389/fphar.2021.738590(IF:5.811)

[12] Guangtao F, Zhenkang W, Zhantao D, et al. Icariin Alleviates Wear Particle-Induced Periprosthetic Osteolysis via Down-Regulation of the Estrogen Receptor α-mediated NF-κB Signaling Pathway in Macrophages. Front Pharmacol. 2021;12:746391. Published 2021 Nov 3. doi:10.3389/fphar.2021.746391(IF:5.811)

[13] Zhu S, Wang W, Zhang J, Ji S, Jing Z, Chen YQ. Slc25a5 regulates adipogenesis by modulating ERK signaling in OP9 cells. Cell Mol Biol Lett. 2022;27(1):11. Published 2022 Feb 2. doi:10.1186/s11658-022-00314-y(IF:5.787)

[14] Liu X, Cheng C, Cai Y, et al. Pan‑cancer analyses reveal the regulation and clinical outcome association of PCLAF in human tumors. Int J Oncol. 2022;60(6):66. doi:10.3892/ijo.2022.5356(IF:5.650)

[15] Lin F, Xie YJ, Zhang XK, et al. GTSE1 is involved in breast cancer progression in p53 mutation-dependent manner. J Exp Clin Cancer Res. 2019;38(1):152. Published 2019 Apr 8. doi:10.1186/s13046-019-1157-4(IF:5.646)

[16] Yu C, Gao HM, Wan G. Macrophages Are Dispensable for Postnatal Pruning of the Cochlear Ribbon Synapses. Front Cell Neurosci. 2021;15:736120. Published 2021 Oct 21. doi:10.3389/fncel.2021.736120(IF:5.505)

[17] Wen Z, Lin S, Li C, et al. MiR-92a/KLF4/p110δ regulates titanium particles-induced macrophages inflammation and osteolysis. Cell Death Discov. 2022;8(1):197. Published 2022 Apr 13. doi:10.1038/s41420-022-00999-2(IF:5.241)

[18] Lv X, Chen J, He J, et al. Gasdermin D-mediated pyroptosis suppresses liver regeneration after 70% partial hepatectomy [published online ahead of print, 2022 May 4]. Hepatol Commun. 2022;10.1002/hep4.1973. doi:10.1002/hep4.1973(IF:5.073)

[19] Li Y, Ping X, Zhang Y, et al. Comparative Transcriptome Profiling of Cold Exposure and β3-AR Agonist CL316,243-Induced Browning of White Fat. Front Physiol. 2021;12:667698. Published 2021 May 4. doi:10.3389/fphys.2021.667698(IF:4.566)

[20] Wang C, Zheng D, Weng F, Jin Y, He L. Sodium butyrate ameliorates the cognitive impairment of Alzheimer's disease by regulating the metabolism of astrocytes. Psychopharmacology (Berl). 2022;239(1):215-227. doi:10.1007/s00213-021-06025-0(IF:4.530)

[21] Wang FH, Qiao K, Shen YH, Wang H, Chai TY. Characterization of the gene family encoding metal tolerance proteins in Triticum urartu: Phylogenetic, transcriptional, and functional analyses. Metallomics. 2021;13(7):mfab038. doi:10.1093/mtomcs/mfab038(IF:4.526)

[22] Sun X, Zhang J, Nie Q. Inferring latent temporal progression and regulatory networks from cross-sectional transcriptomic data of cancer samples. PLoS Comput Biol. 2021;17(3):e1008379. Published 2021 Mar 5. doi:10.1371/journal.pcbi.1008379(IF:4.475)

[23] He Y, Qiu R, Wu B, et al. Transthyretin contributes to insulin resistance and diminishes exercise-induced insulin sensitivity in obese mice by inhibiting AMPK activity in skeletal muscle. Am J Physiol Endocrinol Metab. 2021;320(4):E808-E821. doi:10.1152/ajpendo.00495.2020(IF:4.310)

[24] Zhu S, Zhang J, Wang W, Jiang X, Chen YQ. Blockage of NDUFB9-SCD1 pathway inhibits adipogenesis : Blockage of NDUFB9-SCD1 pathway inhibits adipogenesis. J Physiol Biochem. 2022;78(2):377-388. doi:10.1007/s13105-022-00876-7(IF:4.158)

[25] Sun Z, Qin Y, Liu D, et al. The evolution and functional characterization of CXC chemokines and receptors in lamprey. Dev Comp Immunol. 2021;116:103905. doi:10.1016/j.dci.2020.103905(IF:3.192)