Q：模板用量X 是多少？常用的量是多少？
A:(a)X 表示模板 DNA 量需要实验者在首次实验时进行摸索。首先对模板DNA 进行稀释（一般推荐 5-10 倍），然后模板量梯度上样，选择 CT 值落在 20-30 之间的最佳上样量。
(b)常用的量是逆转录 500-1000ng 总RNA，稀释 10 倍取 1μL cDNA 进行qPCR 实验。
Q：qPCR 实验结果的有效性？为什么建议Ct 值要大于 15？
A:(a)有效性要满足三个条件：（1）标准曲线：扩增效率范围:90-110%，对应斜率为-3--3.5。R2＞0.98。 (扩增效率=10-1/斜率-1)，当斜率=-3.32 时，扩增效率=100%。（2）扩增曲线：S 型曲线，且 Ct 值在 15－35 之间，阴性对照 Ct＞35 或无Ct 值。（3） 熔解曲线：为单一峰。
(b)3-15 个循环的荧光值标准差的 10 倍是荧光阈值，Ct 值太小了会影响曲线。
Q：Rox 的作用？
A:ROX 是一种参比染料，其作用是标准化荧光定量反应中的非PCR 震荡，校正加样误差或者是孔与孔之间的误差，提供一个稳定的基线。
Q：为什么扩增曲线不稳定（扩增曲线平台期锯齿状）？
A:可能原因：a）RNA 纯度低，体系中存在较多杂质；推荐参数：OD260/OD280=1.8-2.0， OD260/OD230＞2.0。随着 qPCR 反应的进行，阻碍反应的因素不断增加，若 RNA 纯度低，杂质多，会进一步影响仪器平台期的算法，导致出现锯齿状。b）仪器长时间未做校准。仪器未校准会使仪器算法错误，导致各种异常结果。
解决方案：a）先梯度加大模板稀释倍数看优化效果。若效果仍不好建议新制备高纯度RNA 重新实验。
b）定期（一般 1 年）进行仪器校准保养。
Q：为什么扩增曲线无法达到平台期？
A:可能原因：a）模板量太低（CT 值 35 左右）。推荐 Ct 值：15＜Ct＜30。原因：Ct 值太大（如 Ct＞30），刚进入指数扩增期几个循环就停止了反应，故无法到达平台期。 b）循环次数太少（30 cycles）；循环次数过少（如 35）导致刚进入指数扩增期几个循环就停止了反应，故无法到达平台期。c）试剂扩增效率低（CT 小，但无法达到平台期，曲线比较“趴”）。
解决方案：a）提高模板量；参考 Q1 的优化方法。b）提高循环次数；推荐循环数：一般 40。低丰度基因可设 45。c）做标准曲线测定扩增效率，若确实偏低，则换试剂。d）增加 Mg2+浓度（会增加非特异扩增）
Q：为什么出现双峰，并且较低峰 Tm 在 80℃之前？
A:较低峰 Tm 在 80℃之前可能原因：存在引物二聚体（一般mRNA 反转录后定量，产物在 100-150bp 左右，峰对应 Tm 值为 80-90℃。若有引物二聚体存在，引物二聚体大小只有几十bp，峰对应 Tm 值在 70-80℃之间。故会在 80℃以前出现一个峰， 80℃以后出现一个峰），模板浓度过低或引物浓度过高。
解决方案：a）适当提高退火温度； b）提高模板量，降低引物浓度； c）重新设计引物。
Q：为什么出现双峰，双峰 Tm 都在 80℃以前？
A:双峰Tm 都在 80℃以前的可能原因：做 MicroRNA 定量时存在引物二聚体。Micro RNA 反转录后定量， 产物在 80-90bp 左右，峰对应Tm 值为 70-80℃，若有引物二聚体存在，引物二聚体大小只有几十 bp，峰对应 Tm 值也在 70-80℃之间。故会在 80℃ 以前出现双峰。
优化方法：提高退火温度、降低引物浓度或重新设计引物等方式优化。
Q：为什么出现双峰，并且双峰Tm 都在 80℃以后？
A:可能原因：a）引物特异性过差导致非特异性产物扩增。b）交叉污染。c）gDNA 污染，可通过 NRC 进行确认。
解决方案：a）Blast 检查引物特异性，差则重新设计引物。b）超净台中操作，注意更换 Tip 头，避免交叉污染。c）通过 NRC 阴性对照进行确认，若有，需重新制备模板。
Q：为什么是单峰，但 Tm 在 80℃之前？
A:可能原因：扩增产物是完全的引物二聚体，可能是未加模板。
注：若 microRNA，则结果正常（做 microRNA 定量时存在引物二聚体。micro RNA 反转录后定量， 产物在 80-90bp 左右，峰对应 Tm 值为 70-80℃，若有引物二聚体存在，引物二聚体大小只有几十bp，峰对应 Tm 值也在 70-80℃之间。故会在 80℃以前出现双峰）。
解决方案：进行高分辨率琼脂糖电泳，检测有无目的条带，以确定模板是否加入。优化方法：新配制无误的反应体系，重新实验。
Q：为什么是单峰，但峰不尖锐？
A:可能原因：存在大小相近的非特异性扩增
解决方案：a）温度跨度不高于 7℃，视为可用结果（即 Tm 值跨度＜7℃可认为是同一种产物）；b）进行高浓度琼脂糖电泳（高分辨率），确认是否为单一条带。
