qPCR实验说简单也简单，说不简单也不简单。完成引物设计后，像做PCR一样，按部就班地加样，上机即可完成实验。但其中又有好多需要注意的小细节，例如管壁需没有挂液，管中需没有气泡、需尽量减少管壁，管盖等直接接触等等，以减少实验误差或者奇怪的实验结果。小翌在这边整理了染料法qPCR实验中几个常见的问题，并给出了可能的原因和解决方案，希望解决大家qPCR实验中的烦恼~

扩增曲线异常篇

扩增曲线对数图基线期异常

【可能原因】基线设置不当。

【解决方案】建议增大基线的终点值。调整例图如下：

扩增曲线对数图曲线分段

【可能原因】基线设置过高。

【解决方案】建议减小基线的终点值。调整例图如下：

扩增曲线线性图不光滑

【可能原因】

1.PCR反应管没有盖紧，反应液泄露。

2.PCR反应液有挂壁。

3.仪器未经过校正（包括自动校正或ROX校正）

4.体系中抑制物较多，导致荧光不稳定。

5.仪器使用过度，导致荧光收集不稳定。

【解决方案】

1.压紧管盖。

2.试剂彻底混匀，充分离心后，小心放入定量仪器中。

3.校正仪器。

4.提升RNA纯度，选择合适的反转录试剂。

扩增曲线线性图平台期出现锯齿状

【可能原因】

1.RNA纯度不好，杂质多。

2.仪器使用时间过长。

【解决方案】

1.重新提取高质量的RNA。

2.稀释RNA模板，降低杂质浓度。

3.校正仪器。

扩增曲线线性图无法到达平台期

【可能原因】

1.模板浓度低（Ct值35左右）。

2.循环数太少（30cycles）。

3.试剂扩增效率低（Ct小，但也无法达到平台期，曲线比较“趴”）。

【解决方案】

1.提高模板浓度。

2.增加循环数。

3.增加Mg²⁺浓度。

扩增曲线线性图平台期“低头”

【可能原因】

1.存在降解（扩增产物降解，SYBR降解）。

2.管盖没有盖好，试剂挥发。

3.模板浓度太高（Ct值太小，荧光阈值拉的高，低头更严重）。

4.管里有气泡，后来气泡消失。

【解决方案】

1.提高体系纯度。

2.降低模板量（稀释模板）。

3.建议减小基线的终点值。

扩增曲线线性出现起伏折线

【可能原因】管中含有气泡，加热过程中破裂。

【解决方案】放入仪器前离心混匀保证管中无气泡残留。

扩增曲线Ct值偏大

【可能原因】

1.模板量低。

2.扩增效率低。

3.PCR产物太长。

4.体系中存在抑制剂。

【解决方案】

1.减少稀释倍数或增加模板量，使Ct值尽量落在15－30之间。

2.优化反应条件，尝试三步法扩增程序或重新设计引物。

3.一般PCR产物长度设计为100 -150 bp之内，不建议超过300bp。

4.建议梯度稀释模板或重新制备纯度更高的模板。

扩增曲线重复性差

【可能原因】

1.加样误差大。

2.试剂和体系未混匀。

3.样品拷贝数低。

4.没有使用Rox校准。

【解决方案】

1. 校准移液器。

2.试剂彻底混匀，配制体系彻底混匀。

3.模板浓度低，重复性差，复孔数4-6个，可适当舍弃1-2个偏差较大数值。

4.最好使用Rox校准。如果使用的试剂不含Rox，需要将参比染料选成None。

扩增曲线杂乱无规律

【可能原因】Rox浓度和机型不匹配

【解决方案】可以在仪器上将参比染料设置由ROX更改为NONE，取消ROX的校正功能，查看扩增曲线是否恢复正常。

NTC起峰

Ct＞35，熔解曲线Tm值＜80℃

【可能原因】引物二聚体导致。

【解决方案】进一步优化引物。

Ct值＜35，NTC熔解曲线与基因熔解曲线峰形重叠

【可能原因】体系有污染。

【解决方案】逐步排查污染源。

熔解曲线异常篇

熔解曲线单峰但不尖锐

【可能原因】

1.与试剂成分，仪器型号有关。

2.存在大小相近的非特异扩增。

【解决方案】

1.起峰到落峰温度跨度不高于7℃ 视为可用结果，即单峰。

2.进行高浓度琼脂糖电泳（如3%琼脂糖）辅助判断。

熔解曲线为双峰且较低峰Tm在80℃之前

【可能原因】存在引物二聚体。

【解决方案】提高退火温度、降低引物浓度或重新设计引物。

熔解曲线为双峰且较低峰Tm在80℃之后

【可能原因】

1.引物特异性过差导致非特异性产物扩增。

2.gDNA污染。

【解决方案】

1.Blast检查引物特异性，差则重新设计。

2.通过NRC阴性对照进行确认，若有，需重新制备模板。

熔解曲线峰型杂乱

【可能原因】

1.反应体系污染。

2.试剂暴露在强光或高温下导致试剂失效。

3.仪器长时间未校准。

4.耗材与仪器不匹配。

【解决方案】

1.结合NTC和NRC结果确认污染情况，建议从水，引物，酶和环境等逐一排除污染。

2.建议用新的试剂做对比实验。

3.建议定期进行仪器校准保养。

4.需确认对应仪器对耗材的要求。

熔解曲线前端起杂峰

【可能原因】Rox浓度与机型不匹配。

【解决方案】建议取消Rox校正查看熔解曲线是否正常。调整例图如下：

以上是小翌整理的染料法qPCR实验异常结果原因和解决方案，可能小伙伴们在日常实验中还会遇到小翌都没见到过的奇奇怪怪的结果，小翌欢迎大家在文末评论中分（tu）享（cao）~

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