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干货|qPCR常见问题及解决方案全新迭代，快来收藏~

在RT-qPCR的实验过程中，大家或多或少都会遇到扩增曲线异常、熔解曲线异常、重复性差等问题。小翌之前给大家整理过SYBR Green染料法的常见问题及解决方案，近半年来，有不少小伙伴又陆续反馈了其它问题，这些问题您也可能碰到哦。在此，小翌将涉及到的问题再次进行归纳总理，快来收藏宝藏内容吧，说不定什么时候就用到了呢~

Part I  扩 增 曲 线 异 常

正常的扩增曲线一般呈S型，Ct值最好在20-30之间。异常的扩增曲线包括Ct值偏大、无平台期、平台期下降等问题。
 

 

 

Ct值偏大（如Ct值＞30）

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1  模板量低或基因表达丰度低，建议增加模板量观察Ct值能否成相应倍数减少。
2  qPCR整个反应条件不适宜或引物设计不当导致扩增效率低，建议通过标准曲线确认扩增效率。
3  扩增产物过长，建议用三步法程序扩增或优化引物，扩增产物长度最好不超过300bp。
4  体系中可能存在抑制剂影响酶的活性，建议梯度稀释模板或重新制备纯度更高的模板。
5  八联排管子或PCR板子与机型不匹配，建议挑选合适的耗材用于实验。
 

 

 

扩增曲线无法达到平台期

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基因丰度低、循环数较少，建议增加循环数或选择适合低丰度基因定量的产品。

 
 

 

 

扩增曲线平台期下降

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可能是基线范围设置太高，这种一般是由于模板量过高导致的。建议减小基线的终点值，可以设置为Ct值-4，调整后见下图：

 

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扩增曲线log图谱基线期异常（如下图）

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可能是基线设置不当，建议增大基线的终点值，可以设置为Ct值-4，调整后如下：

 

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扩增曲线log图谱曲线异常（如下图）

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可能是基线设置太高，建议减小基线的终点值，可以设置为Ct值-4，调整后如下：

 
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扩增曲线不是标准的S型

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可能是样本不纯，比如残留的抑制物造成的，建议通过Nanodrop测定OD260/280检测样本的纯度，也可以通过制作标准曲线确认样本质量，必要时重新制备样本。

 
 

 

 

扩增曲线平台期锯齿状

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1  RNA纯度低，建议梯度加大模板稀释倍数看优化效果或重新制备高纯度RNA重新实验。
2  仪器长时间未校准，建议定期进行仪器校准保养。
 

 

 

扩增曲线杂乱无规律

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可能是ROX浓度和机型不匹配，建议调整ROX浓度，调整后见下图：

 
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【注】可以在仪器上将参比染料设置由ROX更改为NONE，取消ROX的校正功能，查看扩增曲线是否恢复正常，即可判定是否是ROX导致的。
 

 

 

有熔解曲线，无扩增曲线

 
 

可能是扩增程序设置错误，未进行荧光信号搜集，建议重新实验，增加扩增程序中延伸阶段荧光信号的搜集。

 

 

 

扩增曲线有向上或向下的尖峰

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可能是仪器故障，建议维修仪器。

 
 

 

 

阴性对照有扩增

1   NTC有扩增，可能有以下两种情况：
1） Ct＞35，熔解曲线Tm值＜80℃（一般正常qPCR产物，大小在100-300bp之间，熔解曲线Tm大多在80℃以上），可能是引物二聚体导致，可进一步优化引物。
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2） 有Ct值且＜35，表示反应体系被污染，可逐步排除污染源。
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2   NRC有扩增
NTC正常，NRC有Ct值，可能是RNA含有gDNA污染。建议用DNase I消化或使用含有gDNA去除的反转录试剂盒（如Cat NO.11141ES）。
【注】NTC是指将H2O代替模板的阴性对照反应；NRC是指将未反转录的RNA作为模板的阴性对照反应。
 

 

 

复孔重复性差

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1   加样误差导致，建议移液器定期校准，另外可通过扩大反应体系或提前配制好预混液优化。
2  模板量低，建议提高模板量，使Ct值落在15-30之间。
3  仪器长时间未校准，建议定期进行仪器校准保养。

PartII 熔 解 曲 线 异 常

熔解曲线常用来判断qPCR结果的特异性，理想的熔解曲线为单峰，异常的熔解曲线可能会出现双峰、杂乱等情况，下面我们来逐一分析。
 

 

 

熔解曲线出现双峰

1   双峰，杂峰Tm在80℃之前
 
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1） 可能存在引物二聚体，建议降低引物浓度或重新设计引物等方式优化。
2） 可能是模板量过低，促使了引物二聚体的形成，建议提高模板量。
 
2   双峰，杂峰Tm在80℃之后
 
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1） 引物特异性过差导致非特异性产物扩增，建议Blast检查引物特异性或重新设计引物。
2） gDNA污染，可通过NRC进行确认。若NRC有Ct值，可重新制备模板。
 

 

 

熔解曲线单峰但不尖锐

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可能存在大小相近的非特异性产物，建议进行高分辨率琼脂糖电泳确认。

 
 

 

 

熔解曲线单峰但Tm值在80℃以前

推测未加模板，仅有引物二聚体的扩增。进行高分辨率琼脂糖电泳确认产物或重复实验。
 

 

 

熔解曲线峰型杂乱

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1   反应体系污染，结合NTC和NRC结果确认污染情况，建议从水，引物，酶和环境等逐一排除污染。
2   试剂暴露在强光或高温下导致试剂失效，建议用新的试剂做对比实验。
3   仪器长时间未校准，建议定期进行仪器校准保养。
4   耗材与仪器不匹配，需确认对应仪器对耗材的要求。
 

 

 

有扩增曲线，无熔解曲线

可能是熔解程序设置错误，未搜集荧光信号，建议重新实验，增加熔解曲线阶段的信号搜集。

 

 

 

两种试剂平行对比，同一产物Tm值不同

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可能是不同试剂的促解链成分或含量不一样，导致同一产物解链温度Tm值不一样。

 
 

 

 

熔解曲线前端起杂峰

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可能是ROX浓度与机型不匹配，建议取消ROX校正查看熔解曲线是否正常，调整后如下图：

 
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【注】可以在仪器上将参比染料设置由ROX更改为NONE，取消ROX的校正功能，查看熔解曲线是否恢复正常，即可判定是否是ROX导致的。
 
以上就是小翌为大家整理的RT-qPCR实验中可能遇到的问题及相应的建议，如果您还有其它问题，欢迎留言咨询~
 
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