Hieff UNICON® Advanced qPCR SYBR Master Mix是2×实时定量PCR扩增的预溶液，具有荧光强度高，灵敏度高和特异性强，扩增产量高等特点，颜色为蓝色，具有加样示踪的作用。核心组分Hieff UNICON® Taq DNA聚合酶采用抗体法热启动，可以有效抑制样品准备过程中引物退火导致的非特异性扩增。同时配方添加了提升PCR反应扩增效率因子和均衡不同GC含量（30~70%）基因扩增的促进因子，使定量PCR可以在宽广的定量区域内获得良好的线性关系。

 

储存条件

-25~-15℃避光保存，有效期18个月。

 

使用说明

1. 推荐qPCR反应体系

组分	体积 （μL）***	体积 （μL）***	终浓度
Hieff UNICON® Advanced qPCR SYBR Master Mix	25	10	1×
Forward Primer (10 μM)*	1	0.4	0.2 μM
Reverse Primer (10 μM)*	1	0.4	0.2 μM
模板DNA/cDNA**	x	x	-
无菌超纯水	Up to 50	Up to 20	-

表1 qPCR反应体系

*通常引物终浓度为0.2 μM，也可以根据情况在0.1-1.0 μM之间进行调整。

**如模板为未稀释cDNA原液，使用体积不应超过qPCR反应总体积的1/10，最佳模板加入量以保证扩增得到的Ct值在20-30个循环为宜。

***推荐使用20 μL或50 μL，以保证目的基因扩增的有效性和重复性；上机前需充分混匀，避免剧烈震荡产生过多气泡。

 

2. 反应程序

循环步骤	温度	时间	循环数
预变性	95℃	2 min	1
变性	95℃	10 sec	40
退火/延伸*	60℃	30 sec**
熔解曲线阶段*	仪器默认设置		1

表2 qPCR反应程序

*退火温度和时间：请根据引物和目的基因的长度进行调整。

**荧光信号采集：请勿忘记打开荧光信号采集，按照仪器使用说明书要求进行实验程序设置，几种常见仪器的时间设定如下：

20 sec：Applied Biosystems 7700, 7900HT, 7500 Fast

31 sec：Applied Biosystems 7300

32 sec：Applied Biosystems 7500

***熔解曲线：通常情况下可以使用仪器默认程序。

 

适用机型

ABI：7500, 7500 Fast, ViiA7, QuantStudio1, 3 and 5, QuantStudio 6,7,12k Flex;

Stratagene: MX3000P, MX3005P, MX4000P;

Bio-Rad: CFX96, CFX384, iCycler iQ, iQ5, MyiQ, MiniOpticon, Opticon,Opticon 2, Chromo4;

Eppendorf: Mastercycler ep realplex, realplex 2 s;

Qiagen: Corbett Rotor-Gene Q, Rotor-Gene 3000, Rotor-Gene 6000;

Roche Applied Science: LightCycler 480, LightCycler 2.0, Lightcycler 96;

Thermo Scientific: PikoReal Cycler; Cepheid: SmartCycler; Illumina: Eco qPCR

 

引物设计指南

1. 推荐引物长度25 bp左右。扩增产物长度150 bp为佳，可以在100 bp-300 bp内选择。
2. 正向引物和反向引物的Tm值相差不宜超过2℃。引物Tm值60℃-65℃为佳。
3. 引物碱基分布均匀，避免出现连续的4个相同碱基，GC含量控制在50%左右。3’端最后一个碱基最好为G或C。
4. 引物内部或者正反两条引物间最好避免出现有3个碱基以上的互补序列。
5. 引物特异性需要用NCBI BLAST程序进行核对。避免引物 3’端有2个碱基以上的非特异性互补。
6. 设计完成的引物需要进行扩增效率的检测，只有具备相同扩增效率的引物才可用于定量比较分析。

 

注意事项

1. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
2. 解冻后Master Mix可能出现絮状或白色沉淀，手握缓慢溶解并上下轻柔颠倒混匀至溶液澄清，不影响试剂性能。
3. 推荐使用本公司cDNA合成试剂盒（货号：11141ES），以有效去除RNA样品中残留的基因组。
4. 若需要电泳，为了获得清晰的条带，建议将qPCR产物稀释20-30倍后进行电泳。
5. 本产品仅作科研用途！