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化繁为简!小翌带你轻松搞定qPCR数据分析

 
 
 

荧光定量PCRqPCR)是实验室常用的一种技术,该技术可以应用于基因表达分析、基因分型、 病原体检测、SNP分析等。qPCR实验操作简单,原理易懂,但面对一堆凌乱的数据,如何进行结果分析成了头疼的问题,今天小翌将带你学会如何化繁为简,轻松获得可以发表SCI的数据!

 
 

qPCR常用的分析方法有相对定量和绝对定量,需根据不同的实验设计进行选择。本期我们关注的是qPCR常见的应用—基因表达分析,一般选择相对定量法。
 

 

 

实验设计

 


假设目前需要研究光诱导对拟南芥AtSUC2基因表达的影响,以未经过任何处理的拟南芥植株作为对照组,实验组为经过一定光诱导处理过的植株,分别提取RNA进行反转录,以得到的cDNA为模板,选择拟南芥GAPDH基因作为内参,进行qPCR实验。

需要设置的qPCR孔如下:

640.webp.jpg

1)  NTC用来验证PCR体系中是否存在污染;

2)  NRT是指用未经反转录的RNA作为模板,是对gDNA残留的控制;

3)  内参基因用来校正因样品初始浓度不同而造成的差异;

4) 而对照样品的选择一般有以下几种情况:

a. 某处理方法对基因表达的影响,将未处理的样本作为参照样本;

b. 检测基因在不同时间的表达差异,将0时刻的样本作为参照样本;

c. 比较基因在不同组织中的表达差异,人为选定一个组织作为参照样本。

 

这里需要注意的一点是,上面每个材料都设置了3个PCR孔(1、2、3),这是PCR重复,即技术性重复,是为了消除操作误差,正确评估扩增效率。此外还需设置生物学重复即不同的材料(时间、植株、批次、反应板)做的同一实验,目的是校准生物学误差,分析处理是否具有统计意义。具体到本例中,实验组和对照组都需要至少再处理两组拟南芥样本(A、B、C),分别提RNA进行逆转录,再做qPCR,统计时以三个生物学重复的平均值进行分析。
 

 

结果分析—△△Ct法


△△Ct法的特点是只依靠Ct值来计算结果,但前提是目的基因与内参基因的扩增效率较为一致并且都在90-110%之间。

 
 
 

具体的计算公式为:

△Ct= Ct(目的基因)- Ct(内参基因)

△△ Ct= △Ct(实验组)- △Ct(对照组)

RQ=2^-△△Ct

 

假设上面研究光诱导对拟南芥AtSUC2基因表达影响的实验中,qPCR的结果如下:

640.webp (1).jpg

 

计算时,首先我们把对照组的2^-△Ct数据求平均值(上图中为0.00116),然后用2^-△Ct中的每一个数据除以这个平均值,即得到2^-△△Ct的值,最后再整理得到平均值与标准差,表明实验组目的基因表达量相比对照组提高了约9.73倍。

 

结果用Graphpad软件作图如下:

640.webp (2).jpg

利用软件的t检验计算出P value=0.0024<0.05,表明具有统计学差异,结果可信。

结果分析—双标准曲线法

 


在实际应用中,由于目的基因与内参基因的扩增效率常常是不同的,需要重新设计引物,优化反应条件使得扩增效率相同,但其实我们还可以选择更方便的双标准曲线法

这里我们先了解下绝对定量的分析方法。具体的步骤是先通过PCR扩增目的片段,然后将目的片段插入克隆载体中,提取重组质粒,待测序正确后即可作为标准品。质粒DNA量可用Nanodrop等仪器测定,通过拷贝数换算公式转换成具体的质粒拷贝数,然后进行倍比稀释后扩增。以标准品拷贝数的对数值为横坐标,以测得的Ct值为纵坐标绘制标准曲线,根据未知样品的Ct值就可以计算出其绝对拷贝数。

 
 
 

拷贝数计算公式:

拷贝数=(质量÷相对分子质量)×6.02×10^23

 

双标准曲线法是通过分别构建目的基因与内参基因的标准品,进行绝对定量并制作标准曲线,计算出未知样品绝对拷贝数之后再进行比较,因此准确性更高。

 
 
 

具体的计算公式为:

Q=目的基因拷贝数/内参基因拷贝数

RQ=Q实验/Q对照

假设上面研究光诱导对拟南芥AtSUC2基因表达影响的实验中,分别构建AtSUC2与GAPDH的标准品,制作标准曲线如下:

640.webp (3).jpg

 

待测样品目的基因和内参基因的Ct值如下:

640.webp (4).jpg

计算时,首先将目的基因与内参基因的Ct值代入标准曲线的线性关系中,获得目的基因与内参基因分别在实验组和对照组中的绝对拷贝数,然后按公式Q=目的基因拷贝数/内参基因拷贝数,使得目的基因的表达量均一化。最后按公式RQ=Q实验/Q对照,计算出RQ= 9.71,表示目的基因在实验组的表达量比对照组上升9.71倍。

结果用Graphpad软件作图如下:

640.webp (5).jpg

 

利用软件的t检验计算出P value=0.0008<0.05,表明具有统计学差异,结果可信。

本期的qPCR数据分析就到这里结束了,下面小翌为你推荐一波性价比高的产品,让你的实验数据更加准确可靠,快来pick吧!

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