Hifair® AdvanceFast 1st Strand cDNA Synthesis Kit是基于Hifair® III 1st Strand cDNA Synthesis Kit开发的快速逆转录试剂盒,适用于PCR扩增以及RT-qPCR实验。与Hifair® III 1st Strand cDNA Synthesis Kit相比,具有稳定的检出率、特异性、产量保证,且反转录总时长最快可低于6分钟,大大缩短了实验时间。
该试剂盒包含gDNA Digester Mix,可去除RNA模板中残留的基因组DNA污染,保证后续结果更加可靠。该试剂盒提供两种cDNA合成引物:Random Primers N6和Oligo (dT)18,用户可根据需要,选择Random Primers N6,Oligo (dT)18或Gene Specific Primers作为逆转录引物,合成的单链cDNA产物可直接用来进行后续PCR或者qPCR反应。
产品组分
组分编号 |
组分名称 |
产品编号/规格 |
|
11149ES10(10 T) |
11149ES60(100 T) |
||
11149-A |
4× Hifair®AdvanceFast SuperMix |
50 μL |
500 μL |
11149-B |
5×gDNA Digester Mix |
20 μL |
200 μL |
11149-C |
Random Primers(50μM) |
20 μL |
200 μL |
11149-D |
Oligo d(T)18 Primers(50μM) |
20 μL |
200 μL |
11149-E |
RNase-free Water |
200 μL |
1 mL* 2 |
运输和保存方法
冰袋运输。-20℃保存,有效期12个月。逆转录产物可立即用于后续反应,也可-20℃短期保存,若需长期保存,建议分装后,于-80℃保存,避免反复冻融。
第一链cDNA合成操作步骤
一、若实验需要去除残留基因组DNA
1. gDNA消化
在RNase-free离心管中配制如下混合液,用移液器轻轻吹打混匀。42℃孵育2 min。
组分 |
使用量 |
RNase-free H2O |
To 10 μL |
5×gDNA Digester Mix |
2 μL |
Total RNA |
10 pg -5 μg* |
or mRNA |
10 pg-500 ng* |
2. 逆转录反应体系配制(20 μL体系)
组分 |
使用量 |
上一步的反应液 |
10 μL |
4×Hifair®AdvanceFast SuperMix |
5 μL |
Oligo d(T)18 Primers(50μM) |
2 μL |
or Random Primers (* for qPCR)(50μM) |
or 2 μL |
or Gene Specific Primer (2 μM) |
or 1 μL |
RNase-free Water |
To 20 μL |
【注】:1)引物投入量可根据模板投入量调整,如果逆转录产物用于qPCR实验,推荐Oligo (dT)18与Random Primers 1:1混合使用。
2)建议先加入4×Hifair®AdvanceFast SuperMix 混匀后再加入逆转录引物,以保证引物不受gDNA Digester影响。
3)体系配制完成后,请用移液器轻轻吹打混匀。
3. 逆转录程序设置
温度 |
时间 |
55℃ |
5 min |
85℃ |
5 s |
二、若实验无需去除基因组DNA
1. 逆转录反应体系配制(20 μL体系)
组分 |
使用量 |
4×Hifair®AdvanceFast SuperMix |
5 μL |
Oligo d(T)18 Primers(50μM) |
2 μL |
or Random Primers (* for qPCR) (50μM) |
or 2 μL |
or Gene Specific Primer (2 μM) |
or 1 μL |
Total RNA |
10 pg -5 μg |
or mRNA |
10 pg - 500 ng |
RNase-free Water |
To 20 μL |
2. 逆转录程序设置
温度 |
时间 |
55℃ |
5 min |
85℃ |
5 s |
【注】: 1)建议Total RNA的投入量不超过2 μg。如果目的基因的表达丰度低,可增加投入量至最多5μg Total RNA。
2)对于高GC含量模板或者复杂模板,可将逆转录温度提高到60℃。
3)本产品可合成14 kb以下的cDNA序列,如需得到更长的cDNA产物,可适当延长逆转录时间。
注意事项
1)所有操作均应在冰上进行,且操作过程应避免RNase污染。
2)为了您的安全和健康,请穿实验服并佩戴一次性手套操作。
3)本产品仅作科研用途!
HB221108
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