· 背景介绍 ·

近年来，生物制品已应用到生物医药、生物农业、生物能源、生物制造、生物环保等多种领域。随着生物制品的市场占比越来越大，针对生物制品，国家和相关部门也建立起规范的质量管理体系和标准，其中宿主细胞核酸残留问题是备受关注的焦点之一。

生物制品如重组蛋白药、抗体药、疫苗、细胞与基因药物等产品是用连续传代的菌种株/细胞株表达的，因而产品内可能会残存宿主核酸。残留的宿主细胞核酸可能引发细胞因增殖失控变为肿瘤细胞，也有可能存在感染性病毒基因从而加剧体内免疫反应。为了规避上述不良后果，从生物制品安全角度和科研需求的层面，进行有效的核酸残留去除与严格的残留检测是非常重要的。

我国参照WHO、FDA和欧盟的标准，在药典中明确规定酵母、大肠杆菌表达的生物制品中的DNA残留量不超过10ng/剂，CHO和Vero细胞表达的EPO、狂犬疫苗、乙肝疫苗等不超过100或10pg/剂。

01

宿主核酸残留的去除

1.1 主流去除方法的比较

在核酸残留去除工作中，由于DNA带有大量的电荷与其他生物大分子结合从而产生聚集（吸附）、包裹作用而难以完全除去。传统的方法均存在核酸残留去除不净、工作量大、耗时长等缺陷，全能核酸酶则可完美解决此类难点。

方法	作用	特点
离子交换层析	DNA带有大量的负电荷，可以和被阴离子交换剂吸附而除去	负载量大，成本低廉，其缺点是在DNA残留要求严格的情况下难以达到
鱼精蛋白沉淀	鱼精蛋白为碱性蛋白，带有大量的正电荷，能够与DNA结合产生沉淀，从而将DNA去除	操作简便、迅速，能有效降低DNA残留量，其缺点在DNA残留要求严格的情况下难以达到；需
DNase I	DNase I具有DNA酶活性而不是RNA酶活性，主要用于RNA去除DNA	用于蛋白重组等去除DNA活性偏低，效果不理想
全能核酸酶	能够有效讲解各种形式DNA和RNA，对单链、双链、线性、环状和超螺旋形式的DNA和RNA的磷酸二酯键均具有很高的活性，产生5’-磷酸核苷酸和3’-磷酸寡核苷酸	高效去除核酸残留，对核酸没有序列要求，操作简便、耗时短

1.2 翌圣方案

全能核酸酶，又称非限制性核酸内切酶，是一种来源于Serratia Marcescen的非特异性核酸内切酶。无论是实验研究，还是工业生产，全能核酸酶都是目前唯一能够同时有效去除DNA和RNA的酶。翌圣生物UCF.ME^®核酸酶在GMP条件下生产，可高效去除各种样品中的核酸杂质，广泛应用于生物医学的各个领域。

翌圣生物UCF.ME^®核酸酶可降解无论是单链、双链、线性、圆形还是超螺旋形式的DNA及RNA，无碱基偏好性。UCF.ME^®核酸酶具有极高的核酸酶活性以及超强的耐受性，可适用于多种操作环境，能够在非常广泛的条件下（6 M Urea，0.1 M Guanidine HCl，0.4% Triton X-100，0.1% SDS，1 mM EDTA，1 mM PMSF），短时间内就使样品中所有的游离核酸降解成长度为2-5个碱基的长度的5'-单磷酸寡核苷酸。后续也可以通过相应的方法去除UCF.ME^®核酸酶，不影响后续实验。

1.3 产品特性

※可以降解所有形式的DNA和RNA；

※极高的核酸酶活性，样品中的核酸残留经过短时间处理就能降低到皮克级别；

※稳定性高，耐受性强，适应各种操作条件；

※无动物源性、无抗生素；

※GMP条件生产，满足从研发到生产的大规模使用需求；

※审计资料齐全，产品申报无忧。

1.4 性能测试——不同反应条件降解DNA的效率检测

为了测试产品的使用性能，我们分别测试了2种温度条件宿主DNA残留（GAPDH/Actin）和质粒DNA残留情况（Bla），结果显示Yeasen UltraNuclease降解DNA的效率与M公司相当。（注：测试样本为：HEK293+慢病毒质粒）

1.5 使用条件——有效条件与最佳使用条件

针对UltraNuclease，我们还进行了使用条件的测试。测试结果如下表。随着核酸酶使用浓度的升高，所需处理时间成倍性缩短。针对Mg²⁺浓度、pH、温度、DTT、巯基乙醇、单价阳离子、磷酸根离子等的最适浓度条件和有效条件我们均作了严谨的测试。UltraNuclease的耐受性强。

1.6 稳定性测试1——不同因素对酶活的影响

考虑到不同生产或研究过程中涉及众多的因素有可能会影响UltraNuclease的稳定性，我们测定了9大常见因素对酶活的影响。在实际的研究中可以根据自身反应工艺结合我们的测试数据做更加适合的体系优化，更大限度的满足各类特殊需求。

1.7 稳定性测试2——储存温度&反复冻融&运输

酶类产品通常需要非常严格的运输条件、储存条件和冻融次数限制。我们测试了不同温度条件下该酶的酶活变化情况、反复冻融次数对酶活的影响以及干冰运输对酶活的影响。结果显示，-20℃条件下酶活8周均稳定；4℃条件下4周内酶活仅降低20%；37℃条件下酶活可稳定2周。另外再-80至25℃之间冻融10次该酶也表现出较好的酶活特性；冰袋+干冰运输酶活不受影响。

1.8 质量保证

FDA备案
生产流程严格参照ISO9001/GMP的标准，符合GMP生产标准
符合药物IND申报要求
无动物源性、无抗生素：使用植物源性和化学合成原料发酵生产，发酵过程中不添加抗生素

02

宿主核酸残留的检测

全能核酸酶去除样本核酸残留后不免有引入全能核酸酶的影响，针对上述情况，Yeasen也提供了相应的检测方案——UCF.ME^® UltraNuclease Elisa Kit。该试剂盒应用双抗体夹心酶联免疫检测（夹心ELISA）原理检测变性与非变性的UCF.ME^® Ultra Nuclease全能核酸酶的残留，用抗UCF.ME^®Ultra Nuclease的兔多克隆抗体包被微孔板，形成固相抗体，向固相抗体微孔板中加入UCF.ME^®Ultra Nuclease标准品和待测样品，然后加入生物素（Biotin）标记的Anti-Ultra Nuclease多抗，最后加入辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素（SA-HRP），形成抗体+ 抗原+抗体-Biotin+SA-HRP复合物，经过洗涤后加入TMB底物显色；TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色并在酸的作用下最终转换成黄色，颜色的深浅与样品中UCF.ME^®Ultra Nuclease的量呈正相关。本试剂盒检测定量范围0.047-3 ng/mL；检测下限：23.5 pg/mL。

03

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