PacBio单分子实时测序（SMRT）凭借超长读长、无PCR偏好、单分子直接测序的核心优势，成为基因组组装、全长转录组、表观修饰等基因组学研究的黄金平台，而SMRTbell™环状文库作为 PacBio 测序的核心模板，其纯度与成环率直接决定测序数据质量、芯片利用率与有效产出 —— 这一切，都离不开建库最后一步的“精准清道夫”：Exonuclease I（核酸外切酶I）与Exonuclease III（核酸外切酶III）。

图1. SMRT三代测序流程示意图

SMRTbell™文库构建：成环纯度是关键

PacBio 文库构建遵循打断→末端修复→接头连接→杂质消化四步标准流程，每一步都关乎文库成败：

✅DNA 片段化：将基因组 DNA 打断至 HiFi 文库（10–15 kb）或 CLR 文库所需长度；

✅末端修复：将随机断端转为平末端，为接头连接奠定基础；

✅接头连接：DNA 片段两端连接 SMRTbell™发夹接头，形成预环化分子；

✅杂质消化：去除游离接头、接头自连二聚体、未成环线性 DNA，只保留纯净环状 SMRTbell™文库。

图2. SMRTbell™环状文库制备流程

很多实验室常遇到：样本优质、末端修复完整、接头连接充分，但成环率偏低、数据产量不达预期。核心原因就在于：杂质消化不彻底。

接头连接后，体系并非只有目标环状文库，而是混杂大量干扰物：

❎游离 SMRTbell™接头

❎接头自连二聚体

❎未成环线性 DNA 片段

❎单 / 双链 DNA 碎片

这些杂质会抢占测序芯片结合位点、产生高背景噪音、拉低有效数据占比，让前期所有建库努力大打折扣。

Exonuclease I & III：

双酶协同，精准净化无残留

翌圣生物针对 PacBio 建库场景，推出高活性、高特异性核酸外切酶组合，双酶分工明确、协同高效，实现文库 “深度净化”。

Exonuclease I（核酸外切酶 I，Cat#14535ES）

▪️底物专一：特异性降解单链 DNA（ssDNA），从 3′端定向切割；

▪️核心功能：高效清除游离单链接头、单链 DNA 碎片，不损伤双链环状文库；

▪️性能验证：与进口标杆品牌对比，同等酶量下 ssDNA 消化能力完全一致。

图3. 翌圣及进口品牌A*的Exonuclease I对单链DNA的消化能力对比

注：20 μL反应体系中加入300 pmol的单链DNA底物，分别使用不同投入量（0.63、1.25、2.5、5、10、20 U）的翌圣及进口品牌A*的Exonuclease I在37℃下孵育15 min，80℃热失活15 min，琼脂糖凝胶电泳检测单链DNA降解情况。结果显示翌圣的Exonuclease I消化单链DNA的能力与进口品牌A*一致。

Exonuclease III（核酸外切酶 III，Cat#14525ES）

▪️底物专一：优先降解平末端 / 凹陷末端双链 DNA（dsDNA），对环状双链 DNA 无作用；

▪️核心功能：精准去除接头二聚体、未成环线性 DNA，大幅提升文库成环率；

▪️性能验证：对双链底物消化效率优于进口品牌，低酶量即可实现完全降解。

图4. 翌圣及进口品牌A*的Exonuclease III对双链DNA的消化能力对比

注：50 μL反应体系中加入1 μg的λDNA，分别使用不同投入量（0.06、0.31、0.63、1.25、2.5、5、10、20 U）的翌圣及进口品牌A*的Exonuclease III在37℃下孵育30 min，加入终浓度为5.5 mM的EDTA使酶失活，琼脂糖凝胶电泳检测单链DNA降解情况。结果显示翌圣的Exonuclease III消化单链DNA的能力优于进口品牌A*。

文库构建是测序成功的基石，高品质原料酶是构建优质文库的核心保障。除核心的Exo I & III杂质消化双酶外，翌圣生物还提供PacBio文库构建全流程高品质原料酶，覆盖DNA打断、末端修复、接头连接、杂质消化全环节，一站式采购满足实验全需求，品质稳定、性能可靠，助力三代测序实验全程无忧。

PacBio 建库全流程酶原料推荐

产品类别	产品名称	货号
DNA打断	Hieff^® DNA Fragmentation Reagent for NanoporeSEQ/ 长片段片段化酶	13309ES
末端修复	T4 DNA Polymerase T4 DNA聚合酶 (5 U/μL)	12901ES
	T4 polynucleotide Kinase T4多聚核苷酸激酶 (10 U/μL)	12902ES
	Klenow Fragment (3'→5' exo-) Klenow 片段(exo-)	14460ES
接头连接	Premium T4 DNA Ligase Premium T4 DNA连接酶(400 U/μL)	14966ES
杂质消化	Exonuclease I 核酸外切酶I (20 U/μL)	14535ES
杂质消化	Exonuclease III 核酸外切酶III (100 U/μL)	14525ES

参考文献：

[1] Roberts R J, Carneiro M O, Schatz M C. The advantages of SMRT sequencing[J]. Genome biology, 2013, 14(6): 405.

[2] Ardui S, Ameur A, Vermeesch J R, et al. Single molecule real-time (SMRT) sequencing comes of age: applications and utilities for medical diagnostics[J]. Nucleic acids research, 2018, 46(5): 2159-2168.