抗体亲和纯化系列

Protein A、Protein G、Protein L背景介绍

Protein A是一种发现于金黄色葡萄球菌的细胞壁表面蛋白，主要通过与免疫球蛋白（Ig）的Fc区相互作用，结合大多数哺乳动物的IgG，可用于多种抗体（单抗和多抗）的分离纯化。

Protein G是一种分离自G型或C型链球菌属的细胞表面蛋白，与发现于金黄色葡萄球菌的细胞壁表面的Protein A类似，主要通过与免疫球蛋白（Ig）的Fc区相互作用，结合大多数哺乳动物的IgG，可用于多种抗体（单抗和多抗）的分离纯化。在与不用的免疫球蛋白亚类的结合特性上，Protein A 和Protein G结合性能不太一样，相比Protein A，Protein G对牛、羊、马等多克隆抗体有更强的结合力，它还可以结合不能与Protein A很好结合的大鼠lgG、人lgG3和小鼠lgG1。

Protein L是从马格努斯消化链球菌分离出来的能和免疫球蛋白特异性结合的蛋白质，能更广泛地结合各种类型以及亚类的免疫球蛋白，包括所有类型的IgG和单链可变区(ScFv)以及Fab片段。该蛋白只与抗体的kappa链结合而不会影响抗体的抗原结合位点，这一特性使其与蛋白A或蛋白G相比，能更广泛地结合各种来源及亚类的抗体。

表1. Protein A、G、L的抗体亲和性差异分析

	Protein A	Protein G	Protein A/G	Protein L
结合位点	主要与IgG的Fc区域（重链的恒定区）结合。这种结合方式通常不会干扰抗体的抗原结合位点（Fab区）	与Protein A类似，主要结合IgG的Fc区域，但其结合位点和识别范围与Protein A有所不同	结合范围更广，兼容A\G共同点；结合能力更强；实用性更高	不与抗体的Fc区结合，只与抗体的kappa链结合而不会影响抗体的抗原结合位点
优点	对人IgG1、IgG2、IgG4 有很强的结合力，对兔、猪、狗、豚鼠等物种的IgG也有很好的亲和力	相比Protein A，Protein G对牛、羊、马等多克隆抗体有更强的结合力，它还可以结合不能与Protein A很好结合的大鼠lgG、人lgG3和小鼠lgG1	集Protein A和Protein G之长，具有最广泛的IgG结合谱	几乎可以结合所有的Ig类(IgG，IgM，IgA，IgE和IgD)；还可以结合单个轻链（Scfv）和Fab片段
缺点	对人IgG3和小鼠IgG1的结合力很弱，并且几乎不与人IgM、IgA、IgE以及禽类抗体（IgY）结合	仍然不与人IgM、IgA、IgE等其他类型的抗体结合，不能像Protein A一样耐受苛刻的洗脱条件		不结合牛、山羊或绵羊来源的免疫球蛋白

附表1是关于Protein A和Protein G对于不同的免疫球蛋白相对结合力的比较，可用于预测Protein A或Protein G作为亲和介质时的选用指导。对于来自特别物种IgG的最佳结合条件，应该查阅近期的文献，获得最有价值的信息。

抗体亲和纯化

亲和纯化是一种具有可逆反应的生化分离纯化技术，如抗原与抗体。适用于从成分复杂且杂质含量远大于目标物的混合物中提纯目标物。如图1所示，首先填料与介质偶联，结合形成具有特异亲和性的分离介质，再向柱子中注入样本，配体选择性的吸附目标物质，平衡液洗杂，最终用洗脱液将目标物质进行洗脱。

图1.亲和层析示意图

翌圣抗体亲和纯化类产品，以基因改造后的Protein A、Protein G、Protein A/G、Protein L为原料，通过不同化学方法将其定向、高效的偶联到琼脂糖基质上或磁珠表面，不仅降低了蛋白的非特异性结合、实现了介质较高的抗体载量，同时也获得了适用于不同纯化要求的抗体纯化产品，涵盖不同类型填料树脂、自动层析预装柱、纯化磁珠、免疫磁珠，方便使用手动或自动化方式纯化抗体蛋白质。

翌圣抗体纯化产品选购指南

产品系列	纯化树脂系列		预装柱系列	纯化磁珠系列	免疫磁珠系列
产品货号	36401ES、36403ES、36405ES、36408ES		36409ES/36410ES/ 36413ES-36416ES	36427ES-36429ES	36417ES-36420ES
产品名称	耐碱rProtein A Agarose Resin	rProtein A/G、rProtein G、rProtein L Agarose Resin	rProtein A、rProtein G、rProtein L 4FF Chromatography Column,1 mL / 5 mL	rProtein A/G、rProtein A、rProtein G MagAgarose Beads	Protein A/G、Protein A、Protein G、Protein L MagBeads (IP Grade)
配基	耐碱重组 Protein A	重组Protein A/G、Protein G、Protein L	重组Protein A、Protein G、Protein L	重组Protein A/G、Protein A、Protein G	重组Protein A/G、Protein A、Protein G、Protein L
载量	Protein A > 40mg人IgG/mL基质 Protein G > 30mg人IgG/mL基质 Protein A/G > 20mg人IgG/mL基质 Protein L > 15mg人IgG/mL基质			Protein A/G > 20 mg人IgG/mL磁珠 Protein A > 20 mg人IgG/mL磁珠 Protein G > 15 mg人IgG/mL磁珠	Protein A/G > 0.7 mg人IgG/mg磁珠 Protein A > 0.9 mg人IgG/mg磁珠 Protein G > 0.85 mg人IgG/mg磁珠 Protein L > 0.5 mg人IgG/mg磁珠
基质	高度交联4%琼脂糖微球			琼脂糖磁珠	硅基磁珠
平均粒径	45-165 µm			30-100 µm	200 nm
优势	载量高，非特异性结合低		柱效稳定，高载量，高流速，强稳定性，标准接口适配商品化各类中压色谱系统	载量高，特异性高，配套磁力架使用方便	高纯度，高载量，高特异性，配套磁力架使用方便
推荐应用	任意规模抗体纯化		小规模抗体纯化	小规模抗体纯化	IP，COIP

附：rProtein A/G IP/Co-IP Kit（Cat#36421ES）

rProtein A/G IP/Co-IP kit (蛋白A/G免疫（共）沉淀试剂盒)是一种通过高质量的重组Protein A/G磁珠，配合用户自备的特异性抗体，进行目的蛋白免疫沉淀或免疫共沉淀的试剂盒。本试剂盒包含高质量的蛋白A/G免疫磁珠（Cat#36417ES）及经过优化验证的免疫沉淀必要试剂（IP裂解液、蛋白酶抑制剂，上样缓冲液，平衡、洗脱、中和缓冲液）及Mouse IgG、Rabbit IgG。本试剂盒包含足够完成40个反应的试剂，每个反应使用25 uL磁珠，同时可进行10个阴性对照。

产品性能

图2.Protein A纯化结果示意图

FAQ

常见问题	原因分析	推荐解决方案
柱子反压过高	筛板堵塞	清洗或更换筛板
	填料堵塞	参照说明书树脂清洗
		裂解液中含有微小的固体颗粒，建议上柱前使用滤膜(0.22或0.45 μm)过滤，或者离心去除
样品纯化过程中曲线不稳定	样品或Buffer中含气泡	去除样品或柱子中的气泡
		样品和buffer进行脱气
洗脱组分中没有目的蛋白	样品中抗体浓度太低	适当提、高抗体浓度
	抗体被降解	蛋白洗脱后应立即中和，适当提高洗脱液pH
	样本与纯化介质柱不匹配	参照表1选择合适的纯化介质
	电泳loading buffer DTT失效	使用新鲜配制loading buffer
	洗脱缓冲液pH不对	依次用pH3.0, pH 2.5, pH 2.0洗脱，电泳检测产物
	结合缓冲液pH不对	应保证样本和结合缓冲液pH在7.0
回收率逐渐降低	上样量过多	减少上样量
	柱子太脏，载量降低	参照说明书进行树脂清洗
样本中脂蛋白、酚红、小分子污染物等的去除	每毫升样品中加入0.04mL硫酸右旋葡糖酐和1mL 1M CaCl₂沉淀脂蛋白，离心除去
	PVP加入样品中至终浓度为3%沉淀b-脂蛋白和球蛋白，离心去除
	结合缓冲液稀释样本
	脱盐柱除去酚红
	分级沉淀法去除低分子污染物，可采用硫酸铵沉淀，羊脂酸沉淀等方法
抗体药物纯化过程中，降低聚集体含量	在上游细胞培养，控制最佳的收获时机，避免培养过程中抗体聚集
	低pH洗脱液中，加入保护剂（Arg等）
	低pH洗脱后，快速中和
	适当降低亲和层析柱进样量
	样品处理和纯化过程中，保持低温（4-8℃）

产品信息

产品定位	产品名称	货号	规格
纯化树脂	耐碱rProtein A Agarose Resin 耐碱重组Protein A琼脂糖纯化树脂	36401ES08/25/60	5 mL /25 mL/ 100 mL
	rProtein A/G Agarose Resin Protein A/G琼脂糖纯化树脂	36403ES03/05/08/25/60	1 mL /2 mL/ 5 mL/25 mL/ 100 mL
	rProtein G Agarose Resin Protein G琼脂糖纯化树脂	36405ES08/25/60	5 mL /25 mL/ 100 mL/
	rProtein L Agarose Resin 4FF Protein L琼脂糖快速纯化树脂	36408ES08/25/60	5 mL /25 mL/ 100 mL/
纯化预装柱	rProtein A 4FF Chromatography Column, 1 mL 蛋白A纯化预装柱, 1 mL	36409ES03/08	1 mL/ 5x1 mL
	rProtein A 4FF Chromatography Column, 5 mL 蛋白A纯化预装柱, 5 mL	36410ES08/25	5 mL/ 5x5 mL
	rProtein G 4FF Chromatography Column, 1 mL 蛋白G纯化预装柱, 1 mL	36413ES03/08	1 mL/ 5x1 mL
	rProtein G 4FF Chromatography Column, 5 mL 蛋白G纯化预装柱,5 mL	36414ES08/25	5 mL/ 5x5 mL
	rProtein L 4FF Chromatography Column, 1 mL 蛋白L纯化预装柱, 1 mL	36415ES03/08	1 mL/ 5x1 mL
	rProtein L 4FF Chromatography Column, 5 mL 蛋白L纯化预装柱, 5 mL	36416ES08/25	5 mL/ 5x5 mL
纯化磁珠	rProtein A/G MagAgarose Beads 蛋白A/G纯化磁珠	36427ES03/08	1 mL/5 mL
	rProtein A MagAgarose Beads 蛋白A纯化磁珠	36428ES03/08	1 mL/5 mL
	rProtein G MagAgarose Beads 蛋白G纯化磁珠	36429ES03/08	1 mL/5 mL
免疫磁珠	Protein A/G MagBeads (IP Grade) 蛋白A/G免疫磁珠	36417ES03/08	1 mL/5 mL
	rProtein A MagBeads (IP Grade) 蛋白A免疫磁珠	36418ES03/08	1 mL/5 mL
	rProtein G MagBeads (IP Grade) 蛋白G免疫磁珠	36419ES03/08	1 mL/5 mL
	rProtein L MagBeads (IP Grade) 蛋白L免疫磁珠	36420ES03/08	1 mL/5 mL
免疫（共）沉淀试剂盒	rProtein A/G IP/Co-IP Kit 蛋白A/G免疫(共)沉淀试剂盒	36421ES40	40T

参考文献

[1] Shi W, Li W, Zhang J, et al. One-step synthesis of site-specific antibody-drug conjugates by reprograming IgG glycoengineering with LacNAc-based substrates. Acta Pharm Sin B. 2022;12(5):2417-2428. doi:10.1016/j.apsb.2021.12.013(IF:11.614)

[2] Chen LJ, Zhang NN, Zhou CX, et al. Gm364 coordinates MIB2/DLL3/Notch2 to regulate female fertility through AKT activation. Cell Death Differ. 2022;29(2):366-380. doi:10.1038/s41418-021-00861-5(IF:15.828)

[3] Zhang K, Chen S, Yang Q, et al. The Oligodendrocyte Transcription Factor 2 OLIG2 regulates transcriptional repression during myelinogenesis in rodents [published correction appears in Nat Commun. 2022 Jun 1;13(1):3164]. Nat Commun. 2022;13(1):1423. Published 2022 Mar 17.

doi:10.1038/s41467-022-29068-z(IF:14.919)

[4] Tu Q, Liu X, Yao X, et al. RETSAT associates with DDX39B to promote fork restarting and resistance to gemcitabine based chemotherapy in pancreatic ductal adenocarcinoma. J Exp Clin Cancer Res. 2022;41(1):274. Published 2022 Sep 15. doi:10.1186/s13046-022-02490-3(IF:12.658)

[5] Zhang C, Wang Y, Zhu Y, et al. Development and structural basis of a two-MAb cocktail for treating SARS-CoV-2 infections. Nat Commun. 2021;12(1):264. Published 2021 Jan 11. doi:10.1038/s41467-020-20465-w(IF:14.919)

[6] Zhang C, Xu C, Dai W, et al. Functional and structural characterization of a two-MAb cocktail for delayed treatment of enterovirus D68 infections. Nat Commun. 2021;12(1):2904. Published 2021 May 18. doi:10.1038/s41467-021-23199-5(IF:14.919)

[7] Wu RQ, Lao XM, et al. Immune checkpoint therapy-elicited sialylation of IgG antibodies impairs antitumorigenic type I interferon responses in hepatocellular carcinoma. immuni. 2022.11.014. Epub 2022 Dec 22. Immunity. doi: 10.1016/j.(IF:43.474)

附表1. 蛋白A、G对不同物种Ig的结合能力比较

免疫球蛋白亚型	Protein A	Protein G	免疫球蛋白亚型	Protein A	Protein G
Human IgG	++++	++++	Mouse IgG	++++	++++
Human IgG1	++++	++++	Mouse IgG1	+	++++
Human IgG2	++++	++++	Mouse IgG2a	++++	++++
Human IgG3	+	++++	Mouse IgG2b	+++	+++
Human IgG4	++++	++++	Mouse IgG3	++	+++
Human IgM	Use anti-Human IgM		Mouse IgM	Use anti-Mouse IgM
Human IgE	NR	NR	Chicken IgG (IgY)	NR	NR
Human IgA	+	NR	Cow IgG	++	++++
Human IgA1	+	NR	Goat IgG	+	++
Human IgA2	+	NR	Goat IgG1	+	++++
Human IgD	Use anti-Human IgD		Goat IgG2	++++	++++
Rat IgG	+	++	Goat IgM	NR	NR
Rat IgG1	NR	+	Guinea Pig IgG	++++	++
Rat IgG2a	NR	NR	Guinea Pig IgG1	++++	++
Rat IgG2b	NR	+	Guinea Pig IgG2	++++	++
Rat IgG3	+	++	Hamster IgG	+	++
Sheep IgG	+	++	Horse IgG	++	++++
Sheep IgG1	+	++	Rabbit IgG	++++	+++
Sheep IgG2	+	++	Rabbit IgM	NR	NR
Sheep IgM	NR	NR	Rabbit All isotypes	+++	++
Pig IgG	+++	+++	Monkey IgG	++++	++++
Cat IgG	++++	+	Donkey IgG	++	++++
Dog IgG	++	+
(+)= weak binding; (++)= moderate binding; (++++)= strong binding; NR= not recommended; (-)= not tested;