动物组织样本RNA建库全流程指南
动物组织样本RNA建库全流程指南
53
2026-10-09
核糖核酸（RNA）是关键遗传信息载体，其中 mRNA 具有显著时空表达特异性，同一基因在不同组织、发育及生理病理状态下表达差异极大。利用 RNA 测序（RNA-seq）开展转录组分析，可解析基因表达规律，为解析生命机制、筛选疾病标志物与新药靶点提供重要依据。
RNA-seq 已广泛应用于多领域：肿瘤研究中可筛选差异基因，挖掘肿瘤发生发展、转移及耐药关键分子；感染免疫领域能解析宿主病原体免疫应答与信号通路变化；精准医疗中可依托 RNA 表达谱实现肿瘤分子分型，指导诊疗。
但 RNA 稳定性差，极易被广泛存在、耐热耐变性强的 RNase 降解，常规高压灭菌也难以使其完全失活，因此 RNA 建库对操作规范和试剂品质要求远高于 DNA 实验。本文全面梳理动物组织样本 RNA 建库全流程，涵盖样本采集保存、RNA 提取质检、mRNA 富集 /rRNA 去除、文库构建及上机测序等环节，并推荐翌圣生物配套产品。
RNA 因 2'- 羟基化学活性易降解，耐碱、耐热性远弱于 DNA，室温数小时即明显降解。RNase（尤以 RNase A 家族为主） 是主要降解因素，其稳定性强、分布广、微量即可快速降解 RNA，因此 RNA 实验需从试剂耗材、操作、环境三方面严格防控 RNase 污染。
TRIzol 含异硫氰酸胍、苯酚和氯仿，可裂解细胞、灭活 RNase 并变性蛋白脂质；加氯仿离心后 RNA 留存于上层水相，实现分离。该法适配各类动物组织，操作简便、RNA 得率高。
磁珠法依托特异性磁珠吸附技术，经裂解、结合、洗涤、洗脱获得高纯度总 RNA，可抑制 RNase、去除杂质，支持手动操作与 AP 系列自动化高通量提取。
真核总 RNA 中 rRNA 占 80%~90%，mRNA 仅 1%~5%，测序前需富集 mRNA 以提升有效数据量。
Poly (A) 选择法：用 oligo (dT) 磁珠富集带 poly (A) 尾的 mRNA，rRNA 去除率超 95%，仅适用于真核 mRNA。
rRNA 去除法：探针杂交后酶切去除 rRNA，保留全部转录本，适合全转录组分析。
RNA 文库构建相比 DNA 文库多了逆转录步骤，整体流程为：先进行 mRNA 富集或 rRNA 去除，按需将 mRNA 片段化至合适片段，再逆转录合成 cDNA 第一链并合成双链 cDNA，随后完成末端修复、加 A 尾、接头连接，最后通过 PCR 扩增与磁珠纯化得到测序文库。
步骤一：样本采集与保存
样本采集规范：
1. 选取目标组织后，应在取材后5分钟内进行液氮速冻，以最大限度地保留RNA的原始状态
2. 对于体积较大的组织样本（如手术切除的组织块），建议先用无菌剪刀或刀片将组织切成约0.5 cm³的小块，每个小块单独装入冻存管，再进行液氮速冻
3. 记录样本信息，包括样本类型、采集时间、患者信息（如适用）等
样本保存要点：
1. 短期保存（1周以内）：-80℃冰箱，避免反复冻融
2.长期保存（数周以上）：液氮速冻后于-80℃冰箱或气相液氮罐中保存
3.切勿在室温下放置超过30分钟，否则RNA会显著降解⁵
防RNase规范：
1.所有接触样本的耗材（枪头、离心管、匀浆器等）必须使用无RNase产品
2.操作台面用RNase Away或75%乙醇喷洒擦拭
3.全程佩戴手套，操作过程中避免裸手接触样本或耗材
4.配制溶液时使用无RNase的器具和DEPC处理水⁵
1. TRIzol法提取RNA流程：
-
1）组织前处理：取 - 80℃冻存组织，放入液氮预冷的研钵，加液氮研磨成细粉，快速转移至含 TRIzol 的离心管，立即涡旋分散，室温静置 5 分钟完成裂解与 RNase 灭活。
-
2）按 TRIzol 体积的 1/5 加入氯仿，用力振荡 15 秒，室温静置 3 分钟。
-
3）4℃、12000 rpm 离心 15 分钟，溶液分为 RNA 水相、蛋白 / DNA 中间层、脂类有机相三层。
-
4）小心吸取上层含 RNA 的水相，转移至新离心管，避免吸到中间层。
-
5） 加入等体积预冷异丙醇，颠倒混匀，室温静置 10 分钟使 RNA 沉淀。
-
6）4℃、12000 rpm 离心 10 分钟，管底可见白色 RNA 沉淀，小心弃去上清。
-
7）加入预冷的 75% 乙醇（DEPC 水配制）洗涤沉淀，4℃、7500 rpm 离心 5 分钟后弃乙醇，重复洗涤一次
-
8）室温晾干沉淀 5-10 分钟至乙醇完全挥发，勿过度干燥。
-
9）加入 30-50 μL DEPC 处理水或 TE 缓冲液溶解沉淀，65℃金属浴 5 分钟促溶，立即置于冰上。
Trizol法提取RNA流程示意图
2.磁珠法提取RNA流程：
-
1）样本前处理：组织样本液氮研磨成粉，细胞样本离心 / 消化处理，加入含 PT 液的裂解液充分裂解，室温静置 5min。
-
2）RNA 结合磁珠：向裂解液中加结合液与磁珠，混匀孵育使 RNA 吸附磁珠；磁力架吸附磁珠后弃去废液。
-
3）洗涤与去 DNA：依次用洗涤液 A、B 洗涤磁珠除杂；加入 DNase I 消化液室温孵育去除基因组 DNA，再重复洗涤。
-
4）洗脱与保存：磁珠开盖晾干去除乙醇，加洗脱液 60℃震荡洗脱；磁力架吸附后收集 RNA 洗脱液，于 - 80℃保存。
磁珠法提取RNA流程示意图
RNA 质检是 RNA 建库的核心环节，直接决定建库成功率与测序数据质量，主要从纯度、浓度、完整性三方面评估，其中完整性最为关键。
1.纯度检测（NanoDrop）
-
A260/A280：标准值 1.8–2.1；＜1.8 提示蛋白 / 酚残留，＞2.2 提示 RNA 降解。
-
A260/A230：标准值＞2.0；偏低提示糖类、盐离子或有机溶剂残留。
2.浓度检测（Qubit）：
采用 RNA BR/HS 试剂盒精确定量，推荐浓度20–500 ng/μL。
3.完整性检测（核心，Agilent 系统）：
通过RIN 值（1–10，10 为最完整）判断：
-
RIN≥8.0：质量优秀，建库效果最佳
-
RIN 7.0–7.9：质量合格，可常规建库
-
RIN 6.0–6.9：轻度降解，建议用 rRNA 去除方案
-
RIN＜6.0：降解严重，不建议常规建库
4.降解样本电泳特征：
-
完整 RNA：28S rRNA 条带亮、18S rRNA 稍暗，比值约2:1
-
降解 RNA：28S 条带变暗 / 消失，18S 条带异常，整体呈弥散条带
|
建库方案 |
核心方法 |
适用场景 |
核心特点 |
推荐选择依据 |
|
mRNA 建库 |
poly (A) 磁珠富集 |
专注蛋白编码基因 mRNA 表达分析；样本质量优良（RIN≥7） |
操作简便，rRNA 去除效率＞95%，数据聚焦编码区 |
仅研究 mRNA、样本完整度高 |
|
全转录组建库 |
rRNA 探针去除 |
需分析 lncRNA、circRNA、前体 mRNA 等全部转录本；样本轻度降解（RIN 5–7） |
保留所有 RNA 类型信息，兼容降解样本 |
研究非编码 RNA、样本有降解 |
|
通用 RNA 建库 |
兼容 poly (A) 富集 /rRNA 去除（按需选配） |
常规转录组研究，中等质量样本 |
兼容性强，适配多数样本与实验需求 |
常规转录组分析、样本质量中等 |
1.mRNA 富集与磁珠结合：
取 1–4 μg 总 RNA，用 DEPC 处理水补足至 50 μL，加入等体积 oligo (dT) 修饰磁珠悬液并轻柔混匀
2.mRNA 梯度杂交：
置于 PCR 仪完成杂交，65℃孵育 5 min，以每 30 秒降 0.1℃梯度降温至 25℃并保温
3.磁珠吸附弃上清：
离心管放磁力架至磁珠完全吸附、溶液澄清，小心吸弃上清液
4.磁珠反复洗涤：
加 100 μL RNA Binding Buffer 洗涤磁珠，磁力架分离弃液，重复洗涤 1–2 次
5.mRNA 洗脱收集：
加 50 μL DEPC 处理水洗脱 mRNA，磁力架分离后收集含 mRNA 的洗脱液
6.mRNA 片段化：
向 mRNA 中加 5 μL 片段化缓冲液，94℃孵育 2–8 min（2 min≈150–200 bp；4 min≈100–150 bp）
7.片段化终止：
立即加 5 μL 终止液终止反应，将样本置于冰上备用
8.cDNA 第一链合成：
用配套试剂盒加 RNase 抑制剂，按程序合成：25℃ 10 min→42℃ 50 min→70℃ 15 min
9.双链 cDNA 合成：
以第一链 cDNA 为模板，合成双链 cDNA
10.末端修复与加 A 尾：
对双链 cDNA 完成末端修复，并进行 3' 端加 A 尾处理
11.接头连接与纯化：
连接 index 接头，磁珠纯化去除未连接接头
12.文库 PCR 扩增：
按程序扩增：98℃ 45 s；98℃ 15 s、60℃ 30 s、72℃ 30 s，循环 8–12 个
13.文库终纯化：
用 1.0x 比例磁珠纯化，去除引物二聚体与非特异性产物
mRNA建库流程示意图
浓度检测：
使用Qubit和Hieff NGS Library Quant Kit（12801ES）精确定量文库浓度。优质文库浓度应>2 nM。
片段大小检测：
使用Bioanalyzer High Sensitivity DNA Chip检测文库片段大小分布。
-
mRNA建库文库主峰应在300-500 bp范围
-
如果出现明显的引物二聚体峰（<100 bp），需要优化纯化条件⁷
上机测序：
根据测序平台和读长要求，将文库稀释至合适浓度上机。建议PE150（双端150 bp）测序，以获得足够的拼接覆盖度。
1.RNase防护是重中之重：
所有耗材使用无RNase产品，操作台喷洒RNase Away，全程戴手套，避免裸手接触样本；
2.样本采集后立即速冻：
从组织离体到液氮速冻的时间应<5分钟，否则RNA会发生显著降解；
3.RNA样本避免反复冻融：
反复冻融会导致RNA降解，建议分装保存，每管使用一次；
4.RIN值是金标准：
RIN值是评估RNA质量的最重要指标，任何纯度和浓度指标都不能替代RIN值的重要性；
5.降解样本选择rRNA去除方案：
RIN值6-7的样本，使用rRNA去除方案比poly(A)选择可以获得更多有效转录本信息；
6.逆转录反应加入RNase抑制剂：
即使在TRIzol提取过程中已经灭活了RNase，在逆转录体系中加入RNase抑制剂可以提供额外保护；
7.文库扩增循环数的优化：
循环数过高会产生过度扩增，增加偏好性和假阳性；循环数过低会导致文库产量不足。初始优化时建议设置梯度（如8、10、12 cycles），根据最终文库浓度和片段分布选择最优循环数。
|
类别 |
名称 |
用途 |
|
样本处理 |
液氮、研钵/杵或匀浆仪 |
组织研磨和RNA提取 |
|
离心设备 |
高速冷冻离心机（可制冷至4℃） |
RNA分离和洗涤 |
|
温控设备 |
恒温混匀仪、PCR仪、金属浴 |
裂解、孵育和建库各步骤 |
|
纯化设备 |
磁力架（适配1.5 mL离心管） |
mRNA富集和文库纯化 |
|
质检设备 |
NanoDrop/Qubit、Bioanalyzer/TapeStation |
RNA纯度、浓度、完整性和文库质检 |
|
环境控制 |
超净工作台（或专用RNA操作台） |
防止RNase污染 |
|
其他耗材 |
无RNase离心管和枪头、涡旋振荡器等 |
常规实验操作 |
|
分类 |
产品货号 |
产品名称 |
规格 |
|
稳定液 |
RNAsafe-ICE冰冻动植物组织RNA稳定-过渡溶液 |
100 mL |
|
|
稳定液 |
RNAsafe Tissue Stabilizer RNAsafe动植物组织RNA稳定液 |
100 mL |
|
|
RNA提取 |
MolPure® Magnetic Tissue Total RNA Kit 磁珠法组织总RNA提取试剂盒（瓶装） |
20T/50T/100T |
|
|
RNA提取 |
MolPure® Mag Plant RNA Kit磁珠法通用植物RNA提取试剂盒 |
24T/48T |
|
|
mRNA捕获 |
Hieff NGS® mRNA Isolation Master Kit V2 mRNA捕获纯化试剂盒 |
8T/24T/96T/96T（自动化） |
|
|
Hieff NGS® MaxUp Human rRNA Depletion Kit （rRNA & ITS/ETS）人/小鼠/大鼠核糖体去除试剂盒 |
12T/24T/96T |
||
|
rRNA去除 |
Hieff NGS® MagSP rRNA Removal Kit (Bacteria(G- and G+)) with purification beads/磁珠法细菌核糖体去除试剂盒 |
4T/24T/96T |
|
|
rRNA去除 |
Hieff NGS® MagSP rRNA Removal Kit (Mammal) with purification beads/磁珠法哺乳动物通用核糖体去除试剂盒 |
4T/24T/96T |
|
|
RNA建库 |
Hieff NGS® EvoMax RNA Library Prep Kit（dUTP） 预混/预装板式RNA建库试剂盒 |
8T/24T/96T/96T（自动化）/96T（板式） |
|
|
RNA建库 |
Hieff NGS® EvoMax RNA Library Prep Kit (dNTP)板式RNA建库试剂盒、预混版RNA建库试剂盒 |
8T/24T/96T/96T（自动化）/96T（板式） |
|
|
Illumina接头 |
Hieff NGS® Stubby UDI Primer Kit for Illumina®, Set1 |
96× 1 T/96× 2 T |
|
|
Hieff NGS® Stubby UDI Primer Kit for Illumina®, Set2 |
96× 1 T/96× 2 T |
||
|
Hieff NGS® Stubby UDI Primer Kit for Illumina®, Set3 |
96× 1 T/96× 2 T |
||
|
Hieff NGS® Stubby UDI Primer Kit for Illumina®, Set4 |
96× 1 T/96× 2 T |
||
|
MGI接头 |
Hieff NGS® Unique Dual Barcode Primer Kit for MGI®, Set1 |
96× 1 T/96× 2 T |
|
|
Hieff NGS® Unique Dual Barcode Primer Kit for MGI®, Set2 |
96× 1 T/96× 2 T |
||
|
Hieff NGS® Unique Dual Barcode Primer Kit for MGI®, Set3 |
96× 1 T/96× 2 T |
||
|
Hieff NGS® Unique Dual Barcode Primer Kit for MGI®, Set4 |
96× 1 T/96× 2 T |
||
|
DNA纯化分选磁珠 |
Hieff NGS® DNA selection Beads (Superior Ampure XP alternative)DNA纯化分选磁珠 |
1mL/2.5mL/5mL/60mL/450mL |
|
|
文库定量 |
1× dsDNA HS Assay Kit 即用型dsDNA qubit定量试剂 |
100T/500T |
