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Hifair® Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit(gDNA digester plus)

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FAQ

COA

已发表文献

产品描述

 

Hifair® Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit (gDNA digester plus)是含有gDNA去除步骤的cDNA第一链合成试剂盒。该试剂盒基于Hifair® Ⅱ Reverse Transcriptase而开发。该酶热稳定性大幅度提高，可耐受高达50℃的反应温度，适合具有复杂二级结构的RNA模板的逆转录。同时，该酶增强了与模板的亲和力，适合少量模板以及低拷贝基因的逆转录。Hifair® Ⅱ Reverse Transcriptase合成全长cDNA的能力也有了提升，可扩增长达10 kb的cDNA。

该试剂盒包含gDNA digester，可去除RNA模板中残留的基因组DNA污染，保证后续结果更加可靠。该试剂盒提供两种cDNA合成引物：Random Primers N6 和oligo (dT)18，用户可根据需要，选择Random Primers N6，Oligo (dT)18或Gene Specific Primers作为逆转录引物，合成的单链cDNA产物可直接用来进行后续PCR或者qPCR反应。

 

产品组分

 

组分编号

组分名称

产品编号/规格

11121ES60 (100 T)

11121-A

RNase-free H2O

2×1 mL

11121-B

5×gDNA digester Buffer

200 μL

11121-C

gDNA digester

100 μL

11121-D

5×Hifair® Ⅱ Buffer plus

400 μL

11121-E

Hifair® Ⅱ Enzyme Mix

200 μL

11121-F

Oligo (dT)18 (50 μM)

100 μL

11121-G

Random Primers N6 (50 μM)

100 μL

【注】：

1）5×Hifair® Ⅱ Buffer plus包含gDNA digester抑制剂和dNTP。

2）Hifair® Ⅱ Enzyme Mix包含RNase inhibitor。

 

运输和保存方法

 

干冰运输。-20℃保存，有效期18个月。

 

注意事项

 

1）反应液的配制应在冰上操作完成，操作过程应避免RNase污染。

2）建议RNA是溶于水而不是TE中，因为TE会干扰gDNA去除以及逆转录反应。

3）可以不经过基因组去除步骤，直接进行逆转录，这样所得到的结果与使用Hifair® Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit（Cat#11119）效果一致。但是请勿将gDNA digester与11119ES中的5×Hifair® Ⅱ Buffer配套使用，因其不含终止gDNA去除反应的成分，会影响反转录和后续的qPCR实验。

4）为了您的安全和健康，请穿实验服并佩戴一次性手套操作。

5）本产品仅作科研用途！

 

关于逆转录引物的选择

 

1） 如果模板为真核生物来源，建议选择Oligo (dT)18 ，与真核生物mRNA的3’ Poly A尾配对，可获得最高产量的全长cDNA。
2）原核生物RNA的反转录请选用Random Primers N6或者基因特异性引物。
3）Random Primers N6适用性较广，适用于mRNA、rRNA、tRNA、small RNA和LncRNA等模板。

4）使用Random primers N6，进行2 kb以下的cDNA合成时，Random primers N6的使用量为 1-2 μL；2 kb 以上的cDNA合成时，Random primers N6 的使用量为0.4-1 μL。

 

第一链cDNA合成操作步骤

 

一、若实验需要去除残留基因组DNA

1. 在RNase-free离心管中配制如下混合液，用移液器轻轻吹打混匀。42℃孵育2 min。

组分

使用量

RNase-free H2O

To 10 μL

5× gDNA digester Buffer

2 μL

gDNA digester

1 μL

Total RNA

1 ng -5 μg*

or mRNA

1 ng-500 ng*

【注】：* 若后续实验为qPCR，Total RNA投入量为1 ng -1 μg；mRNA的投入量为1 ng-100 ng。若基因的表达丰度很低，最多可投入5 μg Total RNA或500 ng mRNA。

2. 逆转录反应体系配制（20 μL体系）

组分

使用量

RNase-free H2O

To 20 μL

上一步的反应液

10 μL

5× Hifair® Ⅱ Buffer plus

2 μL*

Hifair® Ⅱ Enzyme Mix

2 μL

Random Primers N6 (50 μM)  

1 μL

or Oligo (dT)18 (50 μM)

or Gene Specific Primers (2 μM)

or 1 μL

or 1 μL

【注】：

1）逆转录引物：荧光定量实验推荐Random Primers N6与Oligo (dT)18 1:1混合使用。

2）5×Hifair® Ⅱ Buffer plus加入量（*）：因gDNA digester buffer的影响，本体系中只需要加2 μL。

3）建议先加入5×Hifair® Ⅱ Buffer plus混匀后再添加反转录引物，以保证完全抑制gDNA digester的活性。

 

3. 逆转录程序设置

温度

时间

25℃

5 min

42℃

30 min

85℃

5 min

【注】：逆转录温度：推荐使用42℃。对于高GC含量模板或者复杂模板，可将逆转录温度提高到50℃。

4. 逆转录产物可以-20℃短期保存，若需长期保存，建议分装后，于-80℃保存，避免反复冻融。

二、若实验无需去除基因组DNA

1. 逆转录反应体系配制（20 μL体系）

组分

使用量

RNase-free H2O

To 20 μL

Total RNA

1 ng -5 μg

or mRNA

1 ng-500 ng

5× Hifair® Ⅱ Buffer plus

4 μL*

Oligo (dT)18 (50 μM) or Random Primers N6 (50 μM)

1 μL

Hifair® Ⅱ Enzyme Mix

2 μL

【注】：

1）逆转录引物：荧光定量实验推荐Random Primers N6与Oligo (dT)18 1:1混合使用。

2）5×Hifair® Ⅱ Buffer plus加入量（*）：因无gDNA digester buffer的影响，本体系中需要添加4 μL。

【可选步骤】：针对复杂模板，建议RNA、H2O、反转录引物在65℃保温5 min后，冰上迅速冷却。然后再加入反转录酶和Buffer。

2. 逆转录程序设置参照上述基因组去除后的逆转录程序。

HB220607

400-6111-883