Hifair® III cDNA第一链合成试剂盒(含gDNA去除)|Hifair® III 1st Strand cDNA Synthesis Kit(gDNA digester plus)

Hifair^®III 1st Strand cDNA Synthesis Kit (gDNA digester plus)是含有gDNA去除步骤的cDNA第一链合成试剂盒。该试剂盒基于Hifair^®III Reverse Transcriptase而开发。该酶cDNA合成速度快，且热稳定性大幅度提高，可耐受高达60℃的反应温度，适合具有复杂二级结构的RNA模板的逆转录。同时，该酶增强了与模板的亲和力，适合少量模板以及低拷贝基因的逆转录。Hifair^®III Reverse Transcriptase合成全长cDNA的能力也有了提升，可合成长达19.8 kb的cDNA。

该试剂盒包含gDNA digester Mix，可去除RNA模板中残留的基因组DNA污染，保证后续结果更加可靠。该试剂盒提供两种cDNA合成引物：Random Primers N6和Oligo (dT)₁₈，用户可根据需要，选择Random Primers N6，Oligo (dT)₁₈或Gene Specific Primers作为逆转录引物，合成的单链cDNA产物可直接用来进行后续PCR或者qPCR反应。

产品信息

货号	11139ES10 / 11139ES60
规格	10 T / 100 T

组分信息

组分编号	组分名称	11139ES10	11139ES60
11139-A	RNase-free H₂O	1 mL	2×1 mL
11139-B	5×gDNA Digester Mix	30 μL	300 μL
11139-C	10×Hifair^® III Super Buffer*	20 μL	200 μL
11139-D	Hifair^® III RT Enzyme Mix**	10 μL	100 μL
11139-E	Random Primers N6 (50 μM)	10 μL	100 μL
11139-F	Oligo (dT)₁₈ (50 μM)	10 μL	100 μL

*10×Hifair^® III Super Buffer 包含gDNA digester抑制剂和dNTPs。

** Hifair^® III RT Enzyme Mix 包含RNase inhibitor。

储存条件

-25~-15℃避光储存，有效期18个月。

使用说明

1.关于逆转录引物的选择

1）如果模板为真核生物来源，建议选择Oligo (dT)₁₈ ，与真核生物mRNA的3’Poly A尾配对，可获得最高产量的全长cDNA。

2）原核生物RNA的反转录请选用Random Primers N6或者基因特异性引物。

3）Random Primers N6适用性较广，适用于mRNA、rRNA、tRNA、small RNA和LncRNA等模板。

2.第一链cDNA合成操作步骤

1）若实验需要去除残留基因组DNA

a. gDNA消化

在RNase-free离心管中配制如下混合液，用移液器轻轻吹打混匀。42℃孵育2 min。

组分	使用量
RNase-free H₂O	To 15 μL
5×gDNA Digester Mix	3 μL
Total RNA	10 pg-5 μg*
or mRNA	10 pg-500 ng*

表1 gDNA消化体系*

*若后续实验为qPCR，Total RNA投入量为10 pg -1 μg；mRNA的投入量为10 pg-100 ng。若基因的表达丰度很低，最多可投入5 ug Total RNA或500 ng mRNA。

b. 逆转录反应体系配制（20 μL体系）

组分	使用量
上一步的反应液	15 μL
10×Hifair^® III Super Buffer	2 μL
Hifair^® III RT Enzyme Mix	1 μL
Random Primers N6 (50 μM)	1 μL
or Oligo (dT)₁₈ (50 μM) or Gene Specific Primer (2 μM)	or 1 μL
or Oligo (dT)₁₈ (50 μM) or Gene Specific Primer (2 μM)	or 1 μL
RNase-free H₂O	to 20 μL

表2逆转录体系(以20 μL为例)*

*使用前务必充分混匀，避免剧烈震荡产生过多气泡。

1）逆转录引物：后续进行qPCR时，推荐Random Primers N6与Oligo (dT)₁₈ 1:1混合使用。

2）建议先加入10×Hifair^® III Super Buffer混匀后再添加逆转录引物，以保证完全抑制gDNA digester的活性。

3）体系配制完成后，请用移液器轻轻吹打混匀。

c. 逆转录标准程序设置

温度	时间
25℃	5 min
55℃	15 min
85℃	5 min

表3逆转录标准程序*

*标准程序设置建议。

1）逆转录温度：推荐使用55℃。对于高GC含量模板或者复杂模板，可将逆转录温度提高到60℃。

2）逆转录时间：后续进行qPCR时，推荐15 min；若后续用于PCR时，推荐30 min-60 min。

d. 逆转录快速程序设置

温度	时间
55℃	15 min
85℃	5 sec

表4逆转录快速程序*

*逆转录快速程序适用于中低GC含量（≤55%）或者常规模板后续的荧光定量实验。

e. 产物保存

逆转录产物可以-20℃短期保存，若需长期保存，建议分装后，于-80℃保存，避免反复冻融。

2）若实验无需去除残留基因组DNA

a. RNA模板变性

在RNase-free离心管中配制如下混合液，用移液器轻轻吹打混匀。65℃孵育5 min，迅速置于冰上，并静置3 min。

组分	使用量
RNase-free H₂O	To 17 μL
Total RNA	10 pg -5 μg
or mRNA	10 pg-500 ng
Random Primers N6 (50 μM)	1 μL
or Oligo (dT)₁₈ (50 μM) or Gene Specific Primer (2 μM)	or 1 μL
or Oligo (dT)₁₈ (50 μM) or Gene Specific Primer (2 μM)	or 1 μL

表5 RNA模板变性体系

b. 逆转录反应体系配制（20 μL体系）

组分	使用量
上一步的反应液	17 μL
10×Hifair^® III Super Buffer	2 μL
Hifair^® III RT Enzyme Mix	1 μL

表6逆转录体系(以20 μL为例)*

c. 逆转录标准程序设置

温度	时间
25℃	5 min
55℃	15 min
85℃	5 min

表7逆转录标准程序*

*标准程序设置建议。

1）逆转录温度：推荐使用55℃。对于高GC含量模板或者复杂模板，可将逆转录温度提高到60℃。

2）逆转录时间：后续进行qPCR时，推荐15 min；若后续用于PCR时，推荐30 min-60 min。

d. 逆转录快速程序设置

温度	时间
55℃	15 min
85℃	5 sec

表8逆转录快速程序*

*逆转录快速程序适用于中低GC含量（≤55%）或者常规模板后续的荧光定量实验。

e. 产物保存

逆转录产物可以-20℃短期保存，若需长期保存，建议分装后，于-80℃保存，避免反复冻融。

3）miRNA第一链cDNA茎环法合成操作步骤

a. gDNA消化

在RNase-free离心管中配制如下混合液，用移液器轻轻吹打混匀。42℃孵育2 min。

组分	使用量
RNase-free H₂O	To 15 μL
5×gDNA Digester Mix	3 μL
Total RNA	10 pg -5 μg

表9 gDNA消化体系

b. miRNA逆转录反应体系配制（20 μL体系）

组分	使用量
上一步的反应液	15 μL
10×Hifair^® III Super Buffer	2 μL
Hifair^® III RT Enzyme Mix	1 μL
Gene Specific Primer (10 μM)	1 μL
RNase-free H₂O	to 20 μL

表10 miRNA逆转录体系(以20 μL为例)*

*1）建议先加入10×Hifair^® III Super Buffer混匀后再添加逆转录引物，以保证完全抑制gDNA digester的活性。

*2）体系配制完成后，请用移液器轻轻吹打混匀。

c. miRNA逆转录标准程序设置

温度	时间
25℃	5 min
55℃	15 min
85℃	5 min

表11 miRNA标准扩增程序*

*a. 逆转录时间：后续进行qPCR时，推荐15 min；若后续用于PCR时，推荐30 min-60 min。

注意事项

反应液的配制应在冰上操作完成，操作过程应避免RNase污染。
建议RNA是溶于水而不是TE中，因为TE会干扰gDNA去除以及逆转录反应。
5×gDNA digester Mix、10×Hifair^® III Super Buffer、Hifair^® III RT Enzyme Mix使用前请轻轻上下颠倒混匀，并小心离心至底部。吸取液体时请使用量程合适的移液器，枪头不要插入液面下过深。
为了您的安全和健康，请穿实验服并佩戴一次性手套操作。
qPCR实验推荐基因组去除步骤，保证结果更加真实可靠。
本产品仅作科研用途！

Ver.CN20230407

Q：逆转录反应中的引物如何选择？

A：根据实验目的不同，可按下列建议选择（选择指南可见下表）：

a）对于全长第一链 cDNA 合成，且模板为真核生物来源，推荐选择Oligo (dT)引物。b）当目标区域具有复杂二级结构或模板为原核生物来源，推荐选择 Random Primers 引物。

c）基因特异性引物（GSP）是与模板序列互补的引物，适用于目的序列已知的情况。d）若逆转录后续为 qPCR 实验，可将 Oligo (dT)与Random Primers 混合使用。

逆转录引物选择指南
	特征	优点	缺点	结合方式
Oligo (dT)	1）12-20 个 T； 2）与真核生物 mRNA 的3 ’ Poly A 尾配对。	可合成全长 cDNA。	1 ）仅扩增有 polyA 尾的 mRNA； 2 ）对模板质量要求高。
Random Primers	1）6-9 个碱基； 2）可随机识别模板并结合。	适合复杂结构和微量模板。	特异性低，小片段多。
基因特异性引物（GSP）	识别特定模板序列。	特异性强，灵敏度高。	仅合成特定的序列。

Q：能否用来做 miRNA/circRNA/lncRNA 的逆转录？

A：有 A 尾的 lncRNA 用预混液和 KIT （ 11123/11141/11121/11139）都可以， circRNA、miRNA 和无 A 尾的 lncRNA 用 KIT（11121/11139）。microRNA 需要特殊的茎环引物，需特别针对的逆转录试剂盒。

Q：克隆逆转和定量逆转有什么区别？克隆逆转产物和定量逆转产物可以相互吗？

A：a）目的不同：克隆逆转后的 cDNA 后续用于基因克隆，后续实验以普通 PCR 为主；定量逆转后的 cDNA 后续用于基因定量，后续实验以qPCR 为主。

逆转录过程不同：克隆逆转使用 Oligo dT，保证合成的长度。随机引物使用较少；定量逆转使用 Oligo dT 或随机引物，或两者混合使用。
克隆逆转产物可用于 qPCR，但定量逆转产物不推荐用于普通 PCR，定量逆转试剂中含 Oligo (dT)与 Random Primers 混合引物，产物长度较短，可做短片段 PCR，过长的不适合。

Q：逆转录试剂盒可以逆转真菌（或其他物种）RNA 吗？有没有专门针对真菌（或其他物种）的RNA 逆转录的试剂盒呢？

A：RNA 的物种与逆转录没有很大关系，RNA 质量与逆转录有关。所以，得到 RNA 后，逆转录试剂盒都可以用，没有特别针对的。

Q：RNase 残留降解RNA？

A：原因：若去除试剂中残留 RNase，会使 RNA 发生降解，减少了 RNA 模板量，导致效果差。

检测方法：RNA 去除试剂前后分别进行电泳检测，检测RNA 完整性。优化方法：选用无RNase 级别的 gDNA 去除试剂。

Q: miRNA茎环法逆转录可以用这款产品吗？

A: 可以的，设计特异性引物替代试剂盒中的引物加入到程序中。参考程序如下：

茎环引物（10uM) :1ul

上一步的反应液：15ul

10×super buffer：2ul

RT enzyme mix: 1ul

ddH2O: 1ul

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