Hifair®III 1st Strand cDNA Synthesis Kit (gDNA digester plus)是含有gDNA去除步骤的cDNA第一链合成试剂盒。该试剂盒基于Hifair®III Reverse Transcriptase而开发。该酶cDNA合成速度快，且热稳定性大幅度提高，可耐受高达60℃的反应温度，适合具有复杂二级结构的RNA模板的逆转录。同时，该酶增强了与模板的亲和力，适合少量模板以及低拷贝基因的逆转录。Hifair®III Reverse Transcriptase合成全长cDNA的能力也有了提升，可合成长达19.8 kb的cDNA。
该试剂盒包含gDNA digester Mix，可去除RNA模板中残留的基因组DNA污染，保证后续结果更加可靠。该试剂盒提供两种cDNA合成引物：Random Primers N6和Oligo (dT)18，用户可根据需要，选择Random Primers N6，Oligo (dT)18或Gene Specific Primers作为逆转录引物，合成的单链cDNA产物可直接用来进行后续PCR或者qPCR反应。
产品组分
| 组分编号 | 组分名称 | 11139ES10 | 11139ES60 |
|---|---|---|---|
| 11139-A | RNase-free H2O | 1 mL | 2×1 mL |
| 11139-B | 5×gDNA Digester Mix | 30 μL | 300 μL |
| 11139-C | 10×Hifair® III Super Buffer | 20 μL | 200 μL |
| 11139-D | Hifair® III RT Enzyme Mix | 10 μL | 100 μL |
| 11139-E | Random Primers N6 (50 μM) | 10 μL | 100 μL |
| 11139-F | Oligo (dT)18 (50 μM) | 10 μL | 100 μL |
- 耐热性好：耐受60℃,适合具有复杂二级结构的RNA模板
- 引物灵活：可根据个人需求，搭配引物
- 兼容性高：适合不同GC含量、不同表达丰度基因反转录
- 合成能力强：最长可合成19.8kb的cDNA
-25~-15℃避光储存，有效期18个月。
Q：逆转录反应中的引物如何选择？
A：根据实验目的不同，可按下列建议选择（选择指南可见下表）：
a）对于全长第一链 cDNA 合成，且模板为真核生物来源，推荐选择Oligo (dT)引物。b）当目标区域具有复杂二级结构或模板为原核生物来源，推荐选择 Random Primers 引物。
c）基因特异性引物（GSP）是与模板序列互补的引物，适用于目的序列已知的情况。d）若逆转录后续为 qPCR 实验，可将 Oligo (dT)与Random Primers 混合使用。
| 逆转录引物选择指南 | ||||
| 特征 | 优点 | 缺点 | 结合方式 | |
| Oligo (dT) | 1）12-20 个T；2）与真核生物 mRNA 的3 ’ Poly A 尾配对。 | 可 合 成 全长 cDNA。 | 1 ） 仅扩增有 polyA尾 的mRNA； 2 ） 对模板质 量 要 求高。 |  |
| Random Primers | 1）6-9 个碱基；2）可随机识别模板并结合 | 适 合 复 杂结 构 和 微量模板。 | 特异性低， 小片段多。 |  |
| 基因特异性 引 物（GSP） | 识别特定模板序列。 | 特异性强， 灵敏度高。 | 仅 合 成 特定的序列。 |  |
Q：能否用来做 miRNA/circRNA/lncRNA 的逆转录？
A：有 A 尾的 lncRNA 用预混液和 KIT （ 11123/11141/11121/11139） 都可以， circRNA、miRNA 和无 A 尾的 lncRNA 用 KIT（11121/11139）。microRNA 需要特殊的茎环引物，需特别针对的逆转录试剂盒。
Q：克隆逆转和定量逆转有什么区别？克隆逆转产物和定量逆转产物可以相互吗？
A：a）目的不同：克隆逆转后的 cDNA 后续用于基因克隆，后续实验以普通 PCR 为主； 定量逆转后的 cDNA 后续用于基因定量，后续实验以qPCR 为主。
b） 逆转录过程不同：克隆逆转使用 Oligo dT，保证合成的长度。随机引物使用较少； 定量逆转使用 Oligo dT 或随机引物，或两者混合使用。
c） 克隆逆转产物可用于 qPCR，但定量逆转产物不推荐用于普通 PCR，定量逆转试剂中含 Oligo (dT)与 Random Primers 混合引物，产物长度较短，可做短片段 PCR，过长的不适合。
Q：逆转录试剂盒可以逆转真菌（或其他物种）RNA 吗？有没有专门针对真菌（或其他物种）的RNA 逆转录的试剂盒呢？
A：RNA 的物种与逆转录没有很大关系，RNA 质量与逆转录有关。所以，得到 RNA 后， 逆转录试剂盒都可以用，没有特别针对的。
Q：RNase 残留降解RNA？
A：原因：若去除试剂中残留 RNase，会使 RNA 发生降解，减少了 RNA 模板量，导致效果差。
检测方法：RNA 去除试剂前后分别进行电泳检测，检测RNA 完整性。优化方法：选用无RNase 级别的 gDNA 去除试剂。
Q: miRNA茎环法逆转录可以用这款产品吗？
A: 可以的，设计特异性引物替代试剂盒中的引物加入到程序中。参考程序如下：
茎环引物（10uM) :1ul
上一步的反应液：15ul
10×super buffer：2ul
RT enzyme mix: 1ul
ddH2O: 1ul
Q：25℃那一步反应的意义是什么?
A:引物结合
[1] Ba F, Liu Y, Liu WQ, Tian X, Li J. SYMBIOSIS: synthetic manipulable biobricks via orthogonal serine integrase systems. Nucleic Acids Res. 2022;50(5):2973-2985. doi:10.1093/nar/gkac124(IF:16.971)
[2] Zhang Y, Ding H, Wang X, et al. MK2 promotes Tfcp2l1 degradation via β-TrCP ubiquitin ligase to regulate mouse embryonic stem cell self-renewal. Cell Rep. 2021;37(5):109949. doi:10.1016/j.celrep.2021.109949(IF:9.423)
[3] Liu X, Zhan T, Gao Y, et al. Benzophenone-1 induced aberrant proliferation and metastasis of ovarian cancer cells via activated ERα and Wnt/β-catenin signaling pathways. Environ Pollut. 2022;292(Pt B):118370. doi:10.1016/j.envpol.2021.118370(IF:8.071)
[4] Li C, Song J, Guo Z, et al. EZH2 Inhibitors Suppress Colorectal Cancer by Regulating Macrophage Polarization in the Tumor Microenvironment. Front Immunol. 2022;13:857808. Published 2022 Apr 1. doi:10.3389/fimmu.2022.857808(IF:7.561)
[5] Wu Z, Lu Z, Li L, et al. Identification and Validation of Ferroptosis-Related LncRNA Signatures as a Novel Prognostic Model for Colon Cancer. Front Immunol. 2022;12:783362. Published 2022 Jan 26. doi:10.3389/fimmu.2021.783362(IF:7.561)
[6] Zhang Y, Hu R, Xi B, Nie D, Xu H, Liu A. Mechanisms of Senescence-Related NKG2D Ligands Release and Immune Escape Induced by Chemotherapy in Neuroblastoma Cells. Front Cell Dev Biol. 2022;10:829404. Published 2022 Mar 2. doi:10.3389/fcell.2022.829404(IF:6.684)
[7] Zheng XR, Zhang MJ, Qiao YH, et al. Cyclocarya paliurus Reprograms the Flavonoid Biosynthesis Pathway Against Colletotrichum fructicola. Front Plant Sci. 2022;13:933484. Published 2022 Jun 30. doi:10.3389/fpls.2022.933484(IF:6.627)
[8] Tian Q, Zhou LQ. Lactate Activates Germline and Cleavage Embryo Genes in Mouse Embryonic Stem Cells. Cells. 2022;11(3):548. Published 2022 Feb 4. doi:10.3390/cells11030548(IF:6.600)
[9] Zhang W, Lin J, Li J, et al. Rambutan genome revealed gene networks for spine formation and aril development. Plant J. 2021;108(4):1037-1052. doi:10.1111/tpj.15491(IF:6.486)
[10] Fu S, Tan R, Feng Y, et al. N-methyl-N-nitrosourea induces zebrafish anomalous angiogenesis through Wnt/β-catenin pathway [published online ahead of print, 2022 May 25]. Ecotoxicol Environ Saf. 2022;239:113674. doi:10.1016/j.ecoenv.2022.113674(IF:6.291)
[11] Wang G, Wang X, Ma H, et al. PcWRKY11, an II-d WRKY Transcription Factor from Polygonum cuspidatum, Enhances Salt Tolerance in Transgenic Arabidopsis thaliana. Int J Mol Sci. 2022;23(8):4357. Published 2022 Apr 14. doi:10.3390/ijms23084357(IF:5.924)
[12] Xing YJ, Liu BH, Wan SJ, et al. A SGLT2 Inhibitor Dapagliflozin Alleviates Diabetic Cardiomyopathy by Suppressing High Glucose-Induced Oxidative Stress in vivo and in vitro. Front Pharmacol. 2021;12:708177. Published 2021 Jul 12. doi:10.3389/fphar.2021.708177(IF:5.811)
[13] Wei MP, Yu H, Guo YH, Cheng YL, Xie YF, Yao WR. Synergistic antibacterial combination of Sapindoside A and B changes the fatty acid compositions and membrane properties of Cutibacterium acnes [published online ahead of print, 2021 Nov 19]. Microbiol Res. 2021;255:126924. doi:10.1016/j.micres.2021.126924(IF:5.415)
[14] Li N, Chen J, Geng C, et al. Myoglobin promotes macrophage polarization to M1 type and pyroptosis via the RIG-I/Caspase1/GSDMD signaling pathway in CS-AKI. Cell Death Discov. 2022;8(1):90. Published 2022 Feb 28. doi:10.1038/s41420-022-00894-w(IF:5.241)
[15] Zhang Q, Yang R, Tian Y, et al. Ribavirin inhibits cell proliferation and metastasis and prolongs survival in soft tissue sarcomas by downregulating both protein arginine methyltransferases 1 and 5. Basic Clin Pharmacol Toxicol. 2022;131(1):18-33. doi:10.1111/bcpt.13736(IF:4.084)
[16] Wang PT, Li N, Wang XY, et al. RIG-I, a novel DAMPs sensor for myoglobin activates NF-κB/caspase-3 signaling in CS-AKI model. Mil Med Res. 2021;8(1):37. Published 2021 Jun 21. doi:10.1186/s40779-021-00333-4(IF:3.329)
[17] Peng G, Zhu C, Sun Q, et al. Testicular miRNAs and tsRNAs provide insight into gene regulation during overwintering and reproduction of Onychostoma macrolepis. Fish Physiol Biochem. 2022;48(3):481-499. doi:10.1007/s10695-022-01078-0(IF:2.794)
[18] Ye Z, Xu YJ, Liu Y. Influence of different dietary oil consumption on nutrient malabsorption: An animal trial using Sprague Dawley rats. J Food Biochem. 2021;45(4):e13695. doi:10.1111/jfbc.13695(IF:2.720)
[19] Li Y, Qin G, Du J, Yue P, Zhang Y, Hou N. circRNA LDLRAD3 Enhances the Malignant Behaviors of NSCLC Cells via the miR-20a-5p-SLC7A5 Axis Activating the mTORC1 Signaling Pathway. J Healthc Eng. 2022;2022:2373580. Published 2022 Jan 6. doi:10.1155/2022/2373580(IF:2.682)
[20] Peng G, Sun Q, Chen Y, et al. A comprehensive overview of ovarian small non-coding RNAs in the late overwintering and breeding periods of Onychostoma macrolepis. Comp Biochem Physiol Part D Genomics Proteomics. 2022;42:100967. doi:10.1016/j.cbd.2022.100967(IF:2.674)
[21] Xu Y, Peng W, Han D, et al. Maiwei Yangfei decoction prevents bleomycin-induced pulmonary fibrosis in mice. Exp Ther Med. 2021;22(5):1306. doi:10.3892/etm.2021.10741(IF:2.447)
