基于MGISP-960自动化平台的拟南芥叶片RNA文库构建方法
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2026-08-04
拟南芥是植物分子生物学研究的模式物种，其叶片转录组测序是解析植物生长发育、逆境响应机制的核心技术，而高质量RNA文库是测序精准度的关键。传统人工建库操作繁琐、通量有限，易引入人为误差，影响实验重复性。本文基于MGISP-960高通量自动化样本制备平台，结合配套RNA建库试剂，优化拟南芥叶片RNA文库构建流程。该方法可实现96样本批量自动化处理，有效规避人工操作误差，提升文库质量稳定性与实验效率，可为拟南芥大规模转录组学研究提供标准化、高效的建库技术支撑。
目的：建立适用于水稻叶片的全基因组重测序自动化建库流程
平台：MGISP-960（华大智造）
样本类型：拟南芥叶片
下游应用：分子标记与育种参考、差异基因功能解析、基因调控机制研究等
建库试剂盒：Hieff NGS® EvoMax RNA Library Prep Kit (dNTP) RNA建库试剂盒
货号：12341ES
文库类型：华大
自动化简版流程
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流程分类 |
流程（其他设置默认按12341说明书内容执行，说明书可依据货号在官网搜索下载） |
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1 目标RNA富集和片段化 |
① 加入样本，样本投入量：1000ng （人工）； ② 将样本加入mRNA 磁珠中，进行捕获反应； ③ 清洗磁珠2次，用tris buffer洗脱mRNA； ④ 加入结合液，mRNA再次结合磁珠； ⑤ 清洗磁珠1次，用frag/primer buffer重悬磁珠，进行片段化，片段程序选择94℃-5min。 |
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2 一链cDNA合成 |
在片段化产物中加入一链试剂，进行一链程序孵育。 |
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3 二链cDNA合成 |
在一链产物中加入二链试剂，进行二链程序孵育。 |
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4 接头连接 |
提前将接头从10uM稀释到5uM（人工），加入二链产物和连接试剂，进行连接程序孵育。 |
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5 连接产物纯化和分选 |
① 对连接产物进行纯化，磁珠比例为0.6×； ② 对纯化产物进行片段分选，分选1磁珠比例：0.60×，分选2磁珠比例：0.17x。 |
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6 文库扩增 |
将分选产物和扩增试剂混匀，进行扩增程序富余，扩增循环数选择12。 |
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7 扩增产物纯化 |
对扩增产物进行纯化，磁珠比例为0.9×。 |
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8 建库结束 |
建库结束，弹窗提醒人工取走文库。 |
案例结果展示（检测仪器：Qubit 4.0）
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类型 |
文库体积 |
文库浓度（ng/uL) |
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拟南芥叶片A |
25 |
28.54 |
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拟南芥叶片B |
25 |
21.58 |
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拟南芥叶片C |
25 |
37.38 |
片段大小图（检测仪器：Qsep）
结论：文库浓度均在20-40ng/uL之间，片段大小在400bp左右，满足后续上机测序需求。
相关核心产品目录
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应用 |
产品货号 |
产品名称 |
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RNA建库 |
Hieff NGS® EvoMax RNA Library Prep Kit (dNTP) RNA建库试剂盒 |
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接头 |
Hieff NGS® Unique Dual Barcode Primer Kit for MGI®, Set1（板式MGI平台接头，双端唯一短接头，Set1） |
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纯化磁珠 |
Hieff NGS® DNA selection Beads (Superior Ampure XP alternative)DNA纯化分选磁珠 |
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自动化耗材 |
0.2 mL 96孔PCR板，白色，全裙边（NGS，伯乐款） |
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96孔深孔板，U底（1.3 mL) |
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250 μL盒装滤芯透明无菌吸头 |
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荧光定量QPCR压敏封板膜，内附刮板 |
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文库浓度测定 |
1× dsDNA HS Assay Kit 即用型dsDNA qubit定量试剂 |
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Qubit专用检测管 |
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核酸定量仪荧光计Qubit（单通道） |
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文库条带大小检测 |
GoldBand 100 bp plus DNA Ladder |
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YeaRed Nucleic Acid Gel Stain (10,000× in Water) YeaRed 核酸染料（10,000× 水溶液） |
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Agarose琼脂糖 |
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1x TAE Buffer，TAE 缓冲液(粉末)，PH 8.0，1L |
