Hieff NGS® Ultima Dual-mode RNA Library Prep Kit是兼容Illumina和MGI双平台的total RNA测序文库构建试剂盒，包含RNA片段化试剂，反转录试剂，常规和链特异性ds-cDNA合成试剂，以及文库扩增试剂。可以衔接mRNA纯化试剂盒或rRNA去除试剂盒构建测序文库。二链合成模块配有两种Buffer，客户可根据需要进行常规建库或链特异性建库。其中链特异性二链合成Buffer中将dTTP替换为dUTP，使cDNA第二链中掺入dUTP，而本试剂盒使用的高保真DNA聚合酶无法扩增含尿嘧啶的DNA模板，实现链特异性。提供的所有试剂都经过严格的质量控制和功能验证，最大程度上保证了文库构建的稳定性和重复性。

产品信息

货号	12308ES08 / 12308ES24 / 12308ES96
规格	8 T / 24 T / 96 T

组分信息

组分编号		组分名称	12308ES08	12308ES24	12308ES96
12308-A		2× Frag/Prime Buffer	80 μL	250 μL	930 μL
12308-B		1st Strand Enzyme Mix	16 μL	48 μL	192 μL
12308-C		Strand Specificity Reagent	50 μL	150 μL	580 μL
12308-D		2nd Strand Buffer (dNTP)	240 μL	720 μL	2×1440 μL
12308-E		2nd Strand Buffer (dUTP)	240 μL	720 μL	2×1440 μL
12308-F		2nd Strand Enzyme Master Mix	40 μL	120 μL	480 μL
12308-G		Ligation Enhancer	240 μL	720 μL	2×1440 μL
12308-H		Novel T4 DNA Ligase	40 μL	120 μL	480 μL
12308-I		2×Super Canace® II High-Fidelity Mix	200 μL	600 μL	2×1200 μL
12308-K		Nuclease Free H2O	100 μL	300 μL	1000 μL
12308-*	*	Primer mix	NA	NA	NA
注*：Primer mix为实验必须试剂，但是该成分不包含在本试剂盒，需要额外配置。本试剂盒组分兼容Illumina和MGI双平台，但需要额外配置专属于Illumina®或者MGI®的primer mix(Cat# 13335 Primer Mix for Illumina®以及Cat# 13334 Primer Mix for MGI®)。

储存条件

-25~-15℃保存，有效期1年。

使用说明

实验前请仔细阅读：
一、关于接头连接 (Adapter Ligation)

1. 本公司可提供Illumina®或者MGI®长接头(Barcoded Adapter)试剂盒和短接头试剂盒，客户可根据实验需求进行选择。

2. 我们建议选用高质量的商业化接头。如客户使用自制接头，请委托具有NGS引物合成经验的公司，并备注需进行严格的防污染控制。此外，进行接头退火操作时，请在超净台完成。每次只操作一种接头，防止交叉污染。

3. 使用接头时，请提前将接头取出放在4°C或冰盒上解冻；在室温操作时，实验室温度最好不要超过25°C，防止接头解链。

4. 建库过程中，接头浓度过高或过低都会导致建库成功率变低。本试剂盒操作方案中，所加入的接头体积固定为5 μL，请根据初始的RNA投入量，参考表1对接头进行稀释。接头稀释液请选择0.1×TE buffer，稀释过的接头可在4°C保存48小时。

表1-1 Input Total RNA量与Illumina®接头使用浓度推荐表

Input Total RNA	Illumina® Adapter stock concentration
10 ng	1 μM
100 ng	1.5 μM
500 ng	3 μM
≥1 μg	5 μM

表1-2  Input Total RNA量与MGI®接头使用浓度推荐表

Input Total RNA	MGI® Adapter stock concentration
100–499 ng	2 μM
500–4000 ng	5 μM

*可根据不同类型total RNA样本及投入量，按需求适当调整Adapter使用量

二、关于文库扩增 (Library Amplification)

1. 本试剂盒中的文库扩增组分由本公司第二代高保真DNA聚合酶所组成，在第一代的基础上，大大增强了扩增的均一性，即使是低拷贝的基因，也能进行无偏好性地扩增。

2. 文库扩增步骤需要严格控制扩增循环数。循环数不足，将导致文库产量低；循环数过多，又将导致文库偏好性增加、重复度增加、嵌合产物增加、扩增突变积累等多种不良后果。表2列举了使用本试剂盒进行文库扩增，Input Total RNA 量与相应扩增循环数的推荐。

3. 表2中推荐的循环数可满足绝大多数建库需求，若您的样本质量较差（如降解严重的FFPE样本），可根据实际情况适当增加循环数。mRNA建库时请特别注意，由于不同物种和组织所提取的 Total RNA中，mRNA的含量差异较大，实验中需根据建库起始量、物种类型及样本处理情况适当调整扩增循环数。

表 2 Input Total RNA 量与扩增循环数推荐表*

Input Total RNA	Number of cycles
	Non-stranded	Stranded
10 ng	15	15
100 ng	14	14
500 ng	12	13
1 μg	11	12

【注】：*由于文库产量不仅与投入量和扩增循环数相关，样本质量、片段化条件、分选条件等都会影响产量。建库过程中请根据实际情况综合考虑，选择最合适的建库条件。

三、DNA磁珠纯化与分选 (Bead-based Clean Up and Size Selection)

1. 建库过程中有多个步骤需要使用DNA纯化磁珠，我们推荐使用Hieff NGS® DNA Selection Beads (Yeasen Cat#12601)或AMPure® XP磁珠(Beckman Cat#A63880)进行DNA纯化和分选。

2. 磁珠使用前应先平衡至室温，否则会导致得率下降、分选效果不佳。

3. 磁珠每次使用前都应充分振荡混匀或使用移液器上下吹打充分混匀。

4. 转移上清时，请勿吸取磁珠，即使微量残留都将影响后续文库质量。

5. 磁珠洗涤使用的80%乙醇应现用现配，否则将影响回收效率。

6. 产物洗脱前应将磁珠置于室温干燥。干燥不充分容易造成无水乙醇残留影响后续反应；过分干燥又会导致磁珠开裂进而降低纯化得率。通常情况下，室温干燥3-5 min足以让磁珠充分干燥。

7. DNA纯化或长度分选产物如需保存，可使用0.1×TE Buffer洗脱，产物于4°C可保存2天，-20°C可保存1个月。

四、关于文库质检 (Library Quality Analysis)

1. 通常情况下，构建好的文库可通过长度分布检测和浓度检测来进行质量评价。

2. 文库浓度检测可使用：基于双链DNA荧光染料的方法，如Qubit®、PicoGreen®等；基于qPCR绝对定量的方法。

3. 推荐使用qPCR方法进行文库浓度检测：Qubit®等基于双链DNA荧光染料的浓度测定方法时，无法有效区分单端连接Adapter的产物、两端均未连接Adapter的产物及其他不完整双链结构产物；qPCR绝对定量基于PCR扩增原理，仅定量样品中两端Adapter完整的文库（即可测序的文库），可排除单端或双端都不连接Adapter的不可测序文库的干扰。

4. 文库浓度检测不可使用：基于光谱检测的方法，如NanoDrop®等。

5. 文库长度分布检测，可通过Agilent Bioanalyzer 2100等基于毛细管电泳或微控流原理的设备进行检测。

五、自备材料 (Other Material)

1. mRNA富集试剂盒：Hieff NGS® mRNA Isolation Master Kit V2 (Yeasen Cat#12629)。

2. rRNA去除试剂盒：Hieff NGS MaxUp Human rRNA Depletion Kit(rRNA & ITS/ETS) (Yeasen Cat#12257)或其他rRNA去除试剂盒。

3. RNA纯化磁珠： Hieff NGS® RNA Cleaner (Yeasen Cat#12602)或其他等效产品。

4. DNA纯化磁珠：Hieff NGS® DNA Selection Beads (Yeasen Cat#12601)或AMPure® XP Beads (A63880)或其他等效产品。

5. RNA质控：Agilent 2100 Bioanalyzer RNA 6000 Nano/Pico Chip或其他等效产品。

6.  Adapters：Complete Adapter for Illumina®使用（Cat#13519-13520或其他等效产品）或Complete Adapter for MGI®使用（Cat#13360-13362或其他等效产品）。

7. 文库质检：Agilent 2100 Bioanalyzer DNA 1000 Chip/ High Sensitivity Chip或其他等效产品；文库定量试剂。

8. 其他材料：无水乙醇、无菌超纯水、低吸附枪头、PCR管、磁力架、PCR仪等。

六、建库流程图

 图1 RNA建库原图流程图