total RNA建库试剂盒，搭配mRNA抓取或者核糖体去除试剂盒，试剂盒兼容链特异以及非链特异建库，兼容Illumina测序体系以及MGI测序体系。

Hieff NGS® Ultima Dual-mode RNA Library Prep Kit是兼容Illumina和MGI双平台的total RNA测序文库构建试剂盒，包含RNA片段化试剂，反转录试剂，常规和链特异性ds-cDNA合成试剂，以及文库扩增试剂。可以衔接mRNA纯化试剂盒或rRNA去除试剂盒构建测序文库。二链合成模块配有两种Buffer，客户可根据需要进行常规建库或链特异性建库。其中链特异性二链合成Buffer中将dTTP替换为dUTP，使cDNA第二链中掺入dUTP，而本试剂盒使用的高保真DNA聚合酶无法扩增含尿嘧啶的DNA模板，实现链特异性。提供的所有试剂都经过严格的质量控制和功能验证，最大程度上保证了文库构建的稳定性和重复性。

• 流程缩减：二链合成、末端修复、加A三步合为一步。
• 兼容链特异和非链特异文库：选用dNTP或者dUTP扩增，实现非链特异或链特异文库构建。
• 兼容Illumina和MGI文库：选用primer mix for illumina或primer mix for MGI，实现双平台兼容。

产品应用：mRNA建库、lncRNA建库、m6A建库、RIP-seq、CLIP-seq、降解组、翻译组等

1、RNA片段化条件选择

通过对片段化体系进行优化，本试剂盒mRNA片段化效果更集中，效果更好。片段化条件选择如下：

• 94℃ 5min : 400~500bp;                          
• 94℃ 7min : 350~400bp;                                      
• 94℃ 10min : 250~300bp。

2、植物样本建库数据展示

   不同投入量的拟南芥样本进行RNA建库，RNA文库产量相当或者更高，基因检出数更多， Dup值更低，自连率较低。

3、不同质量RNA样本建库的数据展示

不同DV200 Human FFPE RNA的500ng投入量建库，建库产量高，数据利用率高，Mapping Rate 略高，rRNA残留率低，外显子比例高，样本质量越低，Dup值低。

*DV200 表示样本中大于200nt的RNA 片段所占的比例，对于降解严重的FFPE 样本，DV200值能够更好的反应样本的质量。

-25~-15℃保存。

Q:mRNA文库构建分为链特异性文库和常规文库，这两个文库的区别是什么？

A:操作：在合成第二条链时常规mRNA文库加入dTTP,链特异性mRNA文库加入dUTP

原理：链特异性RNA文库构建在合成第二条链时加入的dNTPs中用dUTP代替dTTP，使cDNA第二条链中包含碱基U。在接头连接之后的文库PCR扩增的步骤使用特异性酶，利用此酶只扩增无U碱基的cDNA链的特性，可去除cDNA第二条链，只保留cDNA第一条链，扩增之后得到的文库就保留了RNA方向性。

Q:收到试剂盒后，误将mRNA Capture Beads放置 -20 ℃保存，是否还可以继续使用？

A:低温会破坏磁珠，不可再继续使用。

Q: 12300、12301、13330、13331适用于哪些样本？

A: 适用于起始模板量为0.1-4 μg（体积≤50 μL）的高质量动物、植物和真菌等真核生物的总RNA。

Q: mRNA 94℃片段化后，是否必须要4℃ Hold？

A: 需要。Frag/Primer Buffer在较高温度条件下都会产生片段化作用，所以片段化后最好立即降温。

Q：mRNA建库流程中的safe stopping points？

A: 一链/二链合成后，可在-20℃保存≤48 h；接头连接后纯化产物，可在4℃保存≤48 h。

Q: mRNA建库试剂盒兼容小RNA建库吗？

A: 不兼容。因为small RNA的长度仅为22 nt左右，而本试剂盒中磁珠抓取片段最低为100bp以上，无法有效富集到small RNA片段。

Q: mRNA试剂盒兼容低质量样本建库吗？

A: 不兼容。本试剂盒原理基于poly(T)磁珠吸附mRNA 3’端A尾回收mRNA ，低质量样本如FFPE（mRNA断裂，无完整的poly A结构）不适用。针对低质量的样本可以选择总RNA建库的试剂盒，搭配去除rRNA的盒子一起使用。

[1]Liu Y, Han R, Zhou L, et al. Comparative performance of the GenoLab M and NovaSeq 6000 sequencing platforms for transcriptome and LncRNA analysis [published correction appears in BMC Genomics. 2022 Jan 26;23(1):81]. BMC Genomics. 2021;22(1):829. Published 2021 Nov 17. doi:10.1186/s12864-021-08150-8(IF:4.547)