Hieff NGS® EvoMax RNA Library Prep Kit（dNTP）是兼容Illumina和MGI双平台的Total RNA测序文库构建试剂盒，本产品有常规管式和预装板两种规格，预装板建库试剂盒无需手动配制或分装，可直接适配自动化上机建库，使用更为便捷。试剂盒包含RNA片段化试剂，反转录试剂，ds-cDNA合成试剂，以及文库扩增试剂。可以衔接mRNA纯化试剂盒或rRNA去除试剂盒构建测序文库。所有试剂都经过严格的质量控制和功能验证，最大程度上保证了文库构建的稳定性和重复性。

产品信息

货号	12341ES24/12341ES96/12341ES97/12341ES98
规格	24 T/96 T/96 T（自动化）/96 T（板式）

组分信息

产品组分	组分名称	12341ES24	12341ES96	12341ES97 （管式自动化96T）	12341ES98 (板式自动化96T)
12341-A	Frag/Prime Buffer	450 μL	2×900 μL	2×1064 μL	8×266 μL
12341-B	1st Reaction Module 2.0	192 μL	768 μL	960 μL	8×120 μL
12341-C	2nd Reaction Module(dNTP)	840 μL	3×1120 μL	3×1280 μL	8×480 μL
12341-D	Ligation Reaction Module	840 μL	3×1120 μL	3×1280 μL	8×480 μL
12341-E	2×Super Canace® II High-Fidelity Mix	600 μL	2×1200 μL	2×1360 μL	8×340 μL
*	Primer Mix*	/	/	/	/

注：* 标注表示该成分不包含在本试剂盒，若建库时，搭配短接头，无需该组分；若建库时搭配完整长接头，则需要额外配置，本试剂盒组分兼容Illumina和MGI双平台，但需要额外配置专属于Illumina®或者MGI®的primer mix(Cat# 13334 Primer Mix for MGI®以及Cat# 13335 Primer Mix for Illumina®)。

** 板式自动化试剂组分排版情况见下图。

图：板式建库试剂盒试剂组分排版图

储存条件

-25~-15℃保存，有效期1年。

注意事项

1.关于操作

1）为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

2）请于使用前将试剂盒各组分置于室温解冻。解冻后上下颠倒数次充分混匀，短暂离心后置于冰上待用。

3）推荐在带热盖的PCR仪中进行各步骤反应，使用前应预热PCR仪至反应温度附近。

4）请使用无RNase污染的耗材，并对实验区域定期进行清理，推荐使用ThermoFisher公司的RNAZap^TM高效核酸去除喷雾去除RNA酶污染。

5）PCR产物因操作不当极容易产生气溶胶污染，进而影响实验结果准确性。推荐将PCR反应体系配制区和PCR产物纯化检测区进行强制性的物理隔离；配备文库构建专用移液器等设备；定时对各实验区域进行清洁（推荐使用ThermoFisher公司的DNAZap^TM高效核酸去除喷雾），以保证实验环境的洁净度。

6）若搭配移液工作站进行自动化建库，可咨询翌圣自动化建库流程。

7）板式试剂盒每孔试剂推荐开封后一次性使用。

8）本产品仅作科研用途！

2.关于接头连接 (Adapter Ligation)

1）本公司可提供Illumina®或者MGI®长接头(Barcoded Adapter)试剂盒和短接头试剂盒，客户可根据实验需求进行选择。

2）我们建议选用高质量的商业化接头。如客户使用自制接头，请委托具有NGS引物合成经验的公司，并备注需进行严格的防污染控制。此外，进行接头退火操作时，请在超净台完成。每次只操作一种接头，防止交叉污染。

3）使用接头时，请提前将接头取出放在4℃或冰盒上解冻；在室温操作时，实验室温度最好不要超过25℃，防止接头解链。

4）建库过程中，接头浓度过高或过低都会导致建库成功率变低。本试剂板操作方案中，所加入的接头体积固定为5 μL，请根据初始的RNA投入量，参考表1对接头进行稀释。接头稀释液请选择0.1×TE buffer，稀释过的接头可在4℃保存48小时。

表1-1 Input Total RNA量与Illumina®接头使用浓度推荐表*

Input Total RNA	Illumina® Adapter stock concentration
10 ng	1 μM
100 ng	1.5 μM
500 ng	3 μM
≥1 μg	5 μM

表1-2  Input Total RNA量与MGI®接头使用浓度推荐表*

Input Total RNA	MGI® Adapter stock concentration
10~99 ng	1 μM
100~499 ng	2 μM
500~4000 ng	5 μM

*可根据不同类型total RNA样本及投入量，按需求适当调整Adapter使用量

3.关于文库扩增 (Library Amplification)

1）本试剂盒中的文库扩增组分由本公司第二代高保真DNA聚合酶所组成，在第一代的基础上，大大增强了扩增的均一性，即使是低拷贝的基因，也能进行无偏好性地扩增。

2）文库扩增步骤需要严格控制扩增循环数。循环数不足，将导致文库产量低；循环数过多，又将导致文库偏好性增加、重复度增加、嵌合产物增加、扩增突变积累等多种不良后果。表2列举了使用本试剂盒进行文库扩增，Input Total RNA 量与相应扩增循环数的推荐。

3）表2中推荐的循环数可满足绝大多数建库需求，若您的样本质量较差（如降解严重的FFPE样本），可根据实际情况适当增加循环数。mRNA建库时请特别注意，由于不同物种和组织所提取的 Total RNA中，mRNA的含量差异较大，实验中需根据建库起始量、物种类型及样本处理情况适当调整扩增循环数。

表2 Input Total RNA 量与扩增循环数推荐表*

Input Total RNA	Number of cycles
10 ng	16
100 ng	14
500 ng	11
1 μg	10

【注】：*由于文库产量不仅与投入量和扩增循环数相关，样本质量、片段化条件、分选条件等都会影响产量。建库过程中请根据实际情况综合考虑，选择最合适的建库条件。

4.DNA磁珠纯化与分选 (Bead-based Clean Up and Size Selection)

1）建库过程中有多个步骤需要使用DNA纯化磁珠，我们推荐使用Hieff NGS® DNA Selection Beads (Yeasen Cat#12601)或AMPure® XP磁珠(Beckman Cat#A63880)进行DNA纯化和分选。

2）磁珠使用前应先平衡至室温，否则会导致得率下降、分选效果不佳。

3）磁珠每次使用前都应充分振荡混匀或使用移液器上下吹打充分混匀。

4）转移上清时，请勿吸取磁珠，即使微量残留都将影响后续文库质量。

5）磁珠洗涤使用的80%乙醇应现用现配，否则将影响回收效率。

6）产物洗脱前应将磁珠置于室温干燥。干燥不充分容易造成无水乙醇残留影响后续反应；过分干燥又会导致磁珠开裂进而降低纯化得率。通常情况下，室温干燥3-5 min足以让磁珠充分干燥。

7）DNA纯化或长度分选产物如需保存，可使用0.1×TE Buffer洗脱，产物于4℃可保存2天，-20℃可保存1个月。

5.关于文库质检 (Library Quality Analysis)

1）通常情况下，构建好的文库可通过长度分布检测和浓度检测来进行质量评价。

2）文库浓度检测可使用：基于双链DNA荧光染料的方法，如Qubit®、PicoGreen®等；基于qPCR绝对定量的方法。

3）推荐使用qPCR方法进行文库浓度检测：Qubit®等基于双链DNA荧光染料的浓度测定方法时，无法有效区分单端连接Adapter的产物、两端均未连接Adapter的产物及其他不完整双链结构产物；qPCR绝对定量基于PCR扩增原理，仅定量样品中两端Adapter完整的文库（即可测序的文库），可排除单端或双端都不连接Adapter的不可测序文库的干扰。

4）文库浓度检测不可使用：基于光谱检测的方法，如NanoDrop®等。

5）文库长度分布检测，可通过Agilent Bioanalyzer 2100等基于毛细管电泳或微控流原理的设备进行检测。

6.自备材料 (Other Material)

1）mRNA富集试剂盒：Hieff NGS® mRNA Isolation Master Kit V2 (Yeasen Cat#12629)。

2）rRNA去除试剂盒：Hieff NGS® MaxUp Human rRNA Depletion Kit (rRNA & ITS/ETS)(Yeasen Cat#12257)或其他rRNA去除试剂盒。

3）RNA纯化磁珠： Hieff NGS® RNA Cleaner (Yeasen Cat#12602)或其他等效产品。

4）DNA纯化磁珠：Hieff NGS® DNA Selection Beads (Yeasen Cat#12601)或AMPure® XP Beads (A63880)或其他等效产品。

5）RNA质控：Agilent 2100 Bioanalyzer RNA 6000 Nano/Pico Chip或其他等效产品。

6）Adapters：Complete Adapter for Illumina®使用（Cat#13519-13520或其他等效产品）或Complete Adapter for MGI®使用（Cat#13360-13362或其他等效产品）。

7. 文库质检

Agilent 2100 Bioanalyzer DNA 1000 Chip/ High Sensitivity Chip或其他等效产品；文库定量试剂。

8. 其他材料

无水乙醇、无菌超纯水、低吸附枪头、PCR管、磁力架、PCR仪等。

建库流程图

图1：RNA建库流程