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Hieff NGS® Ultima Dual-mode mRNA Library Prep Kit是兼容Illumina和MGI双平台的mRNA转录组文库构建试剂盒，本试剂盒将cDNA二链合成与Endprep、dA-tailing进行合并，极大地缩减建库时间。二链合成模块配有两种Buffer，客户可根据需要进行常规建库或链特异性建库。本产品适用于起始模板为10 ng-4 μg不同来源真核生物总RNA样本。经过mRNA分离、片段化、双链cDNA合成、末端修复、加A尾、接头连接和文库扩增，总RNA样品最终转化为兼容Illumina®和MGI®平台测序的文库。
试剂盒包含两个独立模块，BOX-I的核心为纯化mRNA所需的oligo (dT)磁珠。BOX-II包含mRNA片段化试剂，反转录试剂，常规和链特异性ds-cDNA合成，以及后续建库所需的所有试剂。其中链特异性二链合成Buffer中将dTTP替换为dUTP，使cDNA第二链中掺入dUTP，而本试剂盒使用的高保真DNA聚合酶无法扩增含尿嘧啶的DNA模板，实现链特异性。提供的所有试剂都经过严格的质量控制和功能验证，最大程度上保证了文库构建的稳定性和重复性。
产品信息
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货号 |
12309ES08 / 12309ES24 / 12309ES96 |
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规格 |
8 T / 24 T / 96 T |
组分信息
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组分编号 |
组分名称 |
12309ES08 |
12309ES24 |
12309ES96 |
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BOX-I |
12603-A |
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mRNA Capture Beads |
0.4 mL |
1.2 mL |
4.8 mL |
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12603-B |
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Beads Binding Buffer |
0.4 mL |
1.2 mL |
4.8 mL |
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12603-C |
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Beads Wash Buffer |
5 mL |
15 mL |
60 mL |
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12603-D |
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Tris Buffer |
0.4 mL |
1.2 mL |
4.8 mL |
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BOX-II |
12309-A |
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Frag/Prime Buffer |
150 μL |
450 μL |
2×900 μL |
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12309-B |
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1st Strand Enzyme Mix |
16 μL |
48 μL |
192 μL |
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12309-C |
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Strand Specificity Reagent |
50 μL |
150 μL |
580 μL |
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12309-D |
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2nd Strand Buffer (dNTP) |
240 μL |
720 μL |
2×1440 μL |
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12309-E |
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2nd Strand Buffer (dUTP) |
240 μL |
720 μL |
2×1440 μL |
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12309-F |
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2nd Strand Enzyme Master Mix |
40 μL |
120 μL |
480 μL |
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12309-G |
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Ligation Enhancer |
240 μL |
720 μL |
2×1440 μL |
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12309-H |
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Novel T4 DNA Ligase |
40 μL |
120 μL |
480 μL |
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12309-I |
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2×Super Canace® II High-Fidelity Mix |
200 μL |
600 μL |
2×1200 μL |
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12309-* |
* |
Primer mix |
NA |
NA |
NA |
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注：primer mix为建库必须试剂，但该成分不包含在本试剂盒，需要额外配置。本试剂盒组分兼容Illumina和MGI双平台，但需要额外配置专属于Illumina®或者MGI®的primer mix(Cat# 13335 Primer Mix for Illumina®以及Cat# 13334 Primer Mix for MGI®)。 |
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储存条件
Box I：2-8°C保存、Box II：-25~-15℃保存。有效期1年。
使用说明
实验前请仔细阅读：
一、关于接头连接(Adapter Ligation)
1.本公司可提供Illumina®或者MGI®长接头(Barcoded Adapter)试剂盒和短接头试剂盒，客户可根据实验需求进行选择。
2.我们建议选用高质量的商业化接头，如客户使用自制接头，请委托具有NGS引物合成经验的公司，并备注需进行严格的防污染控制。此外，进行接头退火操作时，请在超净台完成。每次只操作一种接头，防止交叉污染。
3.使用接头时，请提前将接头取出放在4°C或冰盒上解冻；室温操作时，实验室温度最好不要超过25°C，防止接头解链。
4.建库过程中，接头浓度过高或过低都会导致建库成功率变低。本试剂盒操作方案中，所加入的接头体积固定为5 μL，请根据初始的RNA投入量，参考表1对接头进行稀释。接头稀释液请选择0.1×TE buffer，稀释过的接头可在4°C保存48 h。
表1-1 Input Total RNA量与Illumina接头浓度推荐表
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Input Total RNA |
Illumina Adapter stock concentration |
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10 ng |
1 μM |
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100 ng |
1.5 μM |
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500 ng |
3 μM |
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≥1 μg |
5 μM |
表1-2 Input Total RNA量与MGI接头使用浓度推荐表
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Input Total RNA |
MGI Adapter stock concentration |
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100–499 ng |
2 μM |
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500–4000 ng |
5 μM |
*可根据不同类型Total RNA样本及投入量，按需求适当调整Adapter使用量
二、关于磁珠纯化与分选 (Bead-based Clean Up and Size Selection)
1. 建库过程中有多个步骤需要使用DNA纯化磁珠，我们推荐使用Hieff NGS® DNA Selection Beads (Yeasen Cat#12601)或AMPure® XP磁珠(Beckman Cat#A63880)进行DNA纯化和分选。
2. 磁珠使用前应先平衡至室温，否则会导致得率下降、分选效果不佳。
3. 磁珠每次使用前都应充分振荡混匀或使用移液器上下吹打充分混匀。
4. 转移上清时，请勿吸取磁珠，即使微量残留都将影响后续文库质量。
5. 磁珠洗涤使用的80%乙醇应现用现配，否则将影响回收效率。
6. 产物洗脱前应将磁珠置于室温干燥。干燥不充分容易造成无水乙醇残留影响后续反应；过分干燥又会导致磁珠开裂进而降低纯化得率。通常情况下，室温干燥3-5 min足以让磁珠充分干燥。
7. DNA纯化或长度分选产物如需保存，可使用0.1×TE Buffer洗脱，产物于4°C可保存2天，-20°C可保存1个月。
三、关于文库扩增 (Library Amplification)
1. 本试剂盒中的文库扩增组分由本公司第二代高保真DNA聚合酶所组成，在第一代的基础上，大大增强了扩增的均一性，即使是低拷贝的基因，也能进行无偏好性地扩增。
2. 文库扩增步骤需要严格控制扩增循环数。循环数不足，将导致文库产量低；循环数过多，又将导致文库偏好性增加、重复度增加、嵌合产物增加、扩增突变积累等多种不良后果。表2列举了使用本试剂盒进行文库扩增，Input Total RNA量与相应扩增循环数的推荐。
表2 Input Total RNA 量与扩增循环数推荐表*
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Input Total RNA |
Number of cycles |
|
|
Non-stranded |
Stranded |
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10 ng |
15 |
15 |
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100 ng |
14 |
14 |
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500 ng |
12 |
13 |
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1 μg |
11 |
12 |
【注】：*由于文库产量不仅与投入量和扩增循环数相关，样本质量、片段化条件、分选条件等都会影响产量。建库过程中请根据实际情况综合考虑，选择最合适的建库条件。
四、自备材料 (Other Materials)
1. DNA纯化磁珠：Hieff NGS® DNA Selection Beads (Yeasen Cat#12601)或AMPure® XP Beads (A63880)或其他等效产品。
2. RNA质控：Agilent 2100 Bioanalyzer RNA 6000 Nano/Pico Chip或其他等效产品。
3. Adapters：Complete Adapter for Illumina®使用（Cat#13519-13520或其他等效产品）或Complete Adapter for MGI®使用（Cat#13360-13362或其他等效产品）。
4. 文库质检：Agilent 2100 Bioanalyzer DNA 1000 Chip/ High Sensitivity Chip或其他等效产品；文库定量试剂。
5. 其他材料：无水乙醇、无菌超纯水、低吸附枪头、PCR管、磁力架、PCR仪等。
五、操作流程
图1 mRNA建库试剂盒流程原理流程图
