Hieff NGS^® ds-cDNA Synthesis Kit是用于Illumina^®/MGI^®测序平台的RNA测序文库的cDNA合成试剂盒，包含高效RNA反转录试剂，常规ds-cDNA合成试剂。可衔接Hieff NGS^® OnePot cDNA&gDNA Library Prep Kit（Yeasen Cat#13502）进行后续建库。本试剂盒提供的所有试剂都经过严格的质量控制和功能验证，最大程度上保证了文库构建的稳定性和重复性。

产品组分

组分编号和名称			13488ES08	13488ES24	13488ES96
13488-A		Random Primer	8 μL	24 μL	96 μL
13488-B		1st Reaction Buffer	64 μL	192 μL	786 μL
13488-C		1st Strand Enzyme Mix	16 μL	48 μL	192 μL
13488-D		2nd Reaction Buffer	56 μL	168 μL	672 μL
13488-E		2nd Strand Enzyme Mix	24 μL	72 μL	288 μL

 

运输与保存方法

干冰运输。-20℃保存。有效期1年。
 

注意事项

关于操作

1. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

2. 请于使用前将试剂盒各组分置于室温解冻。解冻后上下颠倒数次充分混匀，短暂离心后置于冰上待用。

3. 推荐在带热盖的PCR仪中进行各步骤反应，使用前应预热PCR仪至反应温度附近。

4. 请使用无RNase污染的耗材，并对实验区域定期进行清理，推荐使用ThermoFisher公司的RNAZap^TM高效核酸去除喷雾去除RNA酶污染。

5. PCR产物因操作不当极容易产生气溶胶污染，进而影响实验结果准确性。推荐将PCR反应体系配制区和PCR产物纯化检测区进行强制性的物理隔离；配备文库构建专用移液器等设备；定时对各实验区域进行清洁（推荐使用ThermoFisher公司的DNAZap^TM高效核酸去除喷雾），以保证实验环境的洁净度。

6. 本产品仅作科研用途！

 

自备材料（Other Material）

1. DNA纯化磁珠：Hieff NGS^® DNA Selection Beads（Yeasen Cat#12601）或AMPure^® XP Beads（A63880）或其他等效产品。

2. 文库质检：Agilent 2100 Bioanalyzer DNA 1000 Chip/ High Sensitivity Chip或其他等效产品；文库定量试剂。

3. 其他材料：无水乙醇、无菌超纯水、低吸附枪头、PCR管、磁力架、PCR仪等。
 

使用方法

Step 1 RNA变性

1. 将 Random Primer 室温解冻后，颠倒混匀，置于冰上备用。按照下表配置反应液：

表1 RNA预变性反应体系

名称	体积（μL）
Random Primer	1
RNA	14
Total	15

2. 使用移液器轻轻吹打混匀，瞬离将反应液离心至管底。

3. 将上述PCR管置于PCR仪中，按照表2所示设置反应程序，进行RNA的预变性。

表2 RNA预变性反应程序

温度	时间
热盖 75°C	On
70°C	5 min
立即置于冰上	3 min

Step 2 第一链cDNA的合成（1^st Strand Synthesis）

1. 将第一链合成试剂从-20°C取出，室温解冻，颠倒混匀后瞬离。按表3所示，配制第一链cDNA合成的反应液。

表3 第一链cDNA合成反应体系

名称	体积（μL）
变性的RNA	15
1st Reaction Buffer	8
1st Srtand Enzyme Mix	2
Total	25

2. 使用移液器轻轻吹打混匀，瞬离将反应液离心至管底。

3. 将上述PCR管置于PCR仪中，按照表4所示设置反应程序，进行第一链cDNA的合成。反应结束后立即进行第二链cDNA的合成。

表4第一链cDNA合成反应程序

温度	时间
热盖 105°C	On
25°C	5 min
42°C	30 min
85°C	5 min
4°C	Hold

Step 3第二链cDNA的合成（2^nd Strand Synthesis）：

1. 将第二链合成试剂从-20 °C取出，解冻后颠倒混匀；按照表5所示，配制第二链cDNA合成反应液。

表5第二链cDNA合成反应体系

名称	体积（μL）
1st Strand cDNA	25
2nd Reaction Buffer	7
2nd Strand Enzyme Mix	3
Total	35

2. 使用移液器轻轻吹打混匀，瞬离将反应液离心至管底。

3. 将上述PCR管置于PCR仪中，按照表6所示设置反应程序，进行第二链cDNA的合成。

表6 第二链cDNA合成反应程序

温度	时间
热盖	Off
16°C	5 min
4°C	Hold

 

Step 4

第二链cDNA产物可衔接Hieff NGS^® OnePot cDNA&gDNA Library Prep Kit（Yeasen Cat#13502）进行后续建库。

HB220110