Hieff NGS^® EvoMax RNA Library Prep Kit（dUTP）是兼容Illumina和MGI双平台的链特异性RNA测序文库构建试剂盒，本产品有常规管式和预装板式两种规制，预装板式无需手动配制或分装，可直接适配自动化上机建库，使用更为便捷。试剂盒包含RNA片段化试剂，反转录试剂，链特异性ds-cDNA合成试剂，以及文库扩增试剂。可以衔接mRNA纯化试剂盒或rRNA去除试剂盒构建测序文库。本产品优化了逆转录模块，无需放线菌素D便可获得高链特异性文库，更大程度的保证了实验人员安全。所有试剂都经过严格的质量控制和功能验证，最大程度上保证了文库构建的稳定性和重复性。

组分信息

产品组分	组分名称	12340ES24	12340ES96	12340ES97 （管式自动化96T）	12340ES98 (板式自动化96T)
12340-A	Frag/Prime Buffer	450 μL	2×900 μL	2×1064 μL	266×8 μL
12340-B	1st Reaction Module 2.0	192 μL	768 μL	960 μL	120×8 μL
12340-C	2nd Reaction Module(dUTP)	840 μL	2×1680 μL	3×1280 μL	480×8 μL
12340-D	Ligation Reaction Module	840 μL	2×1680 μL	3×1280 μL	480×8 μL
12340-E	2×Super Canace^® II High-Fidelity Mix	600 μL	2×1200 μL	2×1360 μL	340×8 μL
*	Primer Mix*	120 μL	480 μL	640 μL	80×8 μL

注：*标注表示该成分不包含在本试剂盒，需要额外配置，本试剂盒组分兼容Illumina和MGI双平台，但需要额外配置专属于Illumina®或者MGI®的primer mix(Cat# 13334 Primer Mix for MGI^®以及Cat# 13335 Primer Mix for Illumina^®)。

储存条件

-25~-15℃保存，有效期1年。

注意事项

1.关于操作

1）为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

2）请于使用前将试剂盒各组分置于室温解冻。解冻后上下颠倒数次充分混匀，短暂离心后置于冰上待用。

3）推荐在带热盖的PCR仪中进行各步骤反应，使用前应预热PCR仪至反应温度附近。

4）请使用无RNase污染的耗材，并对实验区域定期进行清理，推荐使用ThermoFisher公司的RNAZap^TM高效核酸去除喷雾去除RNA酶污染。

5）PCR产物因操作不当极容易产生气溶胶污染，进而影响实验结果准确性。推荐将PCR反应体系配制区和PCR产物纯化检测区进行强制性的物理隔离；配备文库构建专用移液器等设备；定时对各实验区域进行清洁（推荐使用ThermoFisher公司的DNAZap^TM高效核酸去除喷雾），以保证实验环境的洁净度。

6）本产品仅作科研用途！

2.关于接头连接 (Adapter Ligation)

1）本公司可提供Illumina®或者MGI®长接头(Barcoded Adapter)试剂盒和短接头试剂盒，客户可根据实验需求进行选择。

2）我们建议选用高质量的商业化接头。如客户使用自制接头，请委托具有NGS引物合成经验的公司，并备注需进行严格的防污染控制。此外，进行接头退火操作时，请在超净台完成。每次只操作一种接头，防止交叉污染。

3）使用接头时，请提前将接头取出放在4℃或冰盒上解冻；在室温操作时，实验室温度最好不要超过25℃，防止接头解链。

4）建库过程中，接头浓度过高或过低都会导致建库成功率变低。本试剂板操作方案中，所加入的接头体积固定为5 μL，请根据初始的RNA投入量，参考表1对接头进行稀释。接头稀释液请选择0.1×TE buffer，稀释过的接头可在4℃保存48小时。

表1-1 Input Total RNA量与Illumina®接头使用浓度推荐表*

Input Total RNA	Illumina® Adapter stock concentration
10 ng	1 μM
100 ng	1.5 μM
500 ng	3 μM
≥1 μg	5 μM

表1-2 Input Total RNA量与MGI®接头使用浓度推荐表*

Input Total RNA	MGI® Adapter stock concentration
10~99 ng	1 μM
100~499 ng	2 μM
500~4000 ng	5 μM

*可根据不同类型total RNA样本及投入量，按需求适当调整Adapter使用量

3.关于文库扩增 (Library Amplification)

1）本试剂盒中的文库扩增组分由本公司第二代高保真DNA聚合酶所组成，在第一代的基础上，大大增强了扩增的均一性，即使是低拷贝的基因，也能进行无偏好性地扩增。

2）文库扩增步骤需要严格控制扩增循环数。循环数不足，将导致文库产量低；循环数过多，又将导致文库偏好性增加、重复度增加、嵌合产物增加、扩增突变积累等多种不良后果。表2列举了使用本试剂盒进行文库扩增，Input Total RNA 量与相应扩增循环数的推荐。

3）表2中推荐的循环数可满足绝大多数建库需求，若您的样本质量较差（如降解严重的FFPE样本），可根据实际情况适当增加循环数。mRNA建库时请特别注意，由于不同物种和组织所提取的 Total RNA中，mRNA的含量差异较大，实验中需根据建库起始量、物种类型及样本处理情况适当调整扩增循环数。

表2 Input Total RNA 量与扩增循环数推荐表*

Input Total RNA	Number of cycles
10 ng	16
100 ng	14
500 ng	12
1 μg	11

【注】：*由于文库产量不仅与投入量和扩增循环数相关，样本质量、片段化条件、分选条件等都会影响产量。建库过程中请根据实际情况综合考虑，选择最合适的建库条件。

4.DNA磁珠纯化与分选 (Bead-based Clean Up and Size Selection)

1）建库过程中有多个步骤需要使用DNA纯化磁珠，我们推荐使用Hieff NGS® DNA Selection Beads (Yeasen Cat#12601)或AMPure^® XP磁珠(Beckman Cat#A63880)进行DNA纯化和分选。

2）磁珠使用前应先平衡至室温，否则会导致得率下降、分选效果不佳。

3）磁珠每次使用前都应充分振荡混匀或使用移液器上下吹打充分混匀。

4）转移上清时，请勿吸取磁珠，即使微量残留都将影响后续文库质量。

5）磁珠洗涤使用的80%乙醇应现用现配，否则将影响回收效率。

6）产物洗脱前应将磁珠置于室温干燥。干燥不充分容易造成无水乙醇残留影响后续反应；过分干燥又会导致磁珠开裂进而降低纯化得率。通常情况下，室温干燥3-5 min足以让磁珠充分干燥。

7）DNA纯化或长度分选产物如需保存，可使用0.1×TE Buffer洗脱，产物于4℃可保存2天，-20℃可保存1个月。

5.关于文库质检 (Library Quality Analysis)

1）通常情况下，构建好的文库可通过长度分布检测和浓度检测来进行质量评价。

2）文库浓度检测可使用：基于双链DNA荧光染料的方法，如Qubit®、PicoGreen®等；基于qPCR绝对定量的方法。

3）推荐使用qPCR方法进行文库浓度检测：Qubit®等基于双链DNA荧光染料的浓度测定方法时，无法有效区分单端连接Adapter的产物、两端均未连接Adapter的产物及其他不完整双链结构产物；qPCR绝对定量基于PCR扩增原理，仅定量样品中两端Adapter完整的文库（即可测序的文库），可排除单端或双端都不连接Adapter的不可测序文库的干扰。

4）文库浓度检测不可使用：基于光谱检测的方法，如NanoDrop®等。

5）文库长度分布检测，可通过Agilent Bioanalyzer 2100等基于毛细管电泳或微控流原理的设备进行检测。

6.自备材料 (Other Material)

1）mRNA富集试剂盒：Hieff NGS^® mRNA Isolation Master Kit V2 (Yeasen Cat#12629)。

2）rRNA去除试剂盒：Hieff NGS^® MaxUp Human rRNA Depletion Kit (rRNA & ITS/ETS)(Yeasen Cat#12257)或其他rRNA去除试剂盒。

3）RNA纯化磁珠： Hieff NGS^® RNA Cleaner (Yeasen Cat#12602)或其他等效产品。

4）DNA纯化磁珠：Hieff NGS^® DNA Selection Beads (Yeasen Cat#12601)或AMPure^® XP Beads (A63880)或其他等效产品。

5）RNA质控：Agilent 2100 Bioanalyzer RNA 6000 Nano/Pico Chip或其他等效产品。

6）Adapters：Complete Adapter for Illumina^®使用（Cat#13519-13520或其他等效产品）或Complete Adapter for MGI^®使用（Cat#13360-13362或其他等效产品）。

7. 文库质检

Agilent 2100 Bioanalyzer DNA 1000 Chip/ High Sensitivity Chip或其他等效产品；文库定量试剂。

8. 其他材料

无水乙醇、无菌超纯水、低吸附枪头、PCR管、磁力架、PCR仪等。

建库流程图

图1：RNA建库流程

使用方法

Part I：目标RNA的富集和片段化

该步骤是建库前的目标RNA制备，根据建库需求可选择Poly(A) mRNA Isolation方案（方案A）或rRNA Depletion方案（方案B）。Yeasen Cat#12340建库模块不包含该步骤所用试剂，请客户根据建库需要自备相应的试剂。

方案A：mRNA纯化和片段化 (mRNA Purification and Fragmentation)

1.样本要求

该方案使用Hieff NGS® mRNA Isolation Master Kit V2 (Yeasen Cat#12629)进行mRNA富集。适用于起始模板量为10 ng-4 μg（体积≤50 μL）的高质量动物、植物和真菌等真核生物的总RNA。如初始RNA浓度偏低，体积超过50 μL，可使用Hieff NGS® RNA Cleaner (Yeasen Cat#12602)磁珠进行浓缩。RNA需通过Agilent 2100 Bioanalyzer RNA 6000 Nano/Pico芯片检测，RIN值要求＞7，以保证mRNA有完整的poly(A)尾结构。本试剂盒的mRNA分离模块使用的是oligo (dT)磁珠，只有带poly(A)尾的mRNA才能被提取；其他不具poly(A)尾的RNA，如非编码RNA、无poly(A)尾的mRNA等不能适用本试剂盒。此外，FFPE样本中的mRNA降解严重，通常无完整的poly(A)尾结构，故亦无法使用本试剂盒进行建库。

2.操作步骤

1）将mRNA Capture Beads2.0从2-8℃取出，静置使其温度平衡至室温，约30 min。

2）准备一个Nuclease free离心管，取10 ng-4 μg总RNA，用Nuclease Free水将体积补至50 μL，冰上放置备用。

3）颠倒或旋涡振荡混匀磁珠，吸取50 μL磁珠悬液加入至50 μL总RNA样品中，用移液器吹打6次，使其充分混匀。

4）将磁珠与RNA的混合物置于PCR仪中，65℃，5 min；25℃，5 min；25℃，hold，完成RNA与捕获磁珠的结合。

5）将样品置于磁力架中，室温静置5 min，使mRNA与总RNA分离，小心移除上清。

6）将样品从磁力架上取出，用200 μL Beads Wash Buffer2.0重悬磁珠，移液器反复吹打6次以彻底混匀。将样品置于磁力架中，室温静置5 min，小心移除上清。

7）重复步骤6，共洗涤两次。

8）将样品从磁力架上取出，加入50 μL Tris Buffer2.0重悬磁珠，用移液器反复吹打6次以彻底混匀。

9）将样品置于PCR仪中，80℃，2 min；25℃，hold，将mRNA洗脱下来。

10）将样品从PCR仪中取出，加入50 μL Beads Binding Buffer2.0，用移液器反复吹打6次以彻底混匀。

11）室温放置5 min，使mRNA结合到磁珠上。

12）将样品置于磁力架中，室温静置5 min，小心移除上清。

13）将样品从磁力架上取出，用200 μL Beads Wash Buffer2.0重悬磁珠，移液器反复吹打6次以彻底混匀，将样品重新放回至磁力架中，室温静置5 min，吸掉全部上清。

14）将样品从磁力架上取出，衔接本产品，用18.5 μL Frag/Prime Buffer重悬磁珠，用移液器吹打6次以彻底混匀；将样品置于PCR仪中（预设为94℃），可参考表3选择片段化程序，但不同物种片段化的效果有差异，客户可先根据自己的情况，做个片段化时间的梯度，比如94℃，5 min。使用Agilent 2100分析mRNA纯化产物大小。

表3 mRNA片段化程序推荐

插入片段大小 (bp)	打断程序
200-300	94℃, 10 min，4℃，hold；
300-400	94℃, 7 min，4℃，hold；
400-500	94℃, 5 min，4℃，hold；

15）片段化程序结束后，为防止poly(A)尾RNA与磁珠结合，请立即将样品置于磁力架中，待溶液澄清后，转移17 μL上清至一个新的Nuclease Free离心管中，立刻进入第一链合成反应 (Part II-步骤1)。

方案B：rRNA去除与RNA片段化 (rRNA Depletion and RNA Fragmentation)

1.样本要求

该方案使用Hieff NGS® MaxUp Human rRNA Depletion Kit (rRNA & ITS/ETS) (Yeasen Cat#12257)去除Total RNA中的rRNA。适用于人、小鼠、大鼠来源的100 ng~1 μg （体积≤10 μL）总RNA样品；适用于完整或部分降解RNA（如FFPE RNA）样品。

2.操作步骤

1）探针杂交

a.将探针和杂交Buffer从-20℃ 取出，解冻后颠倒混匀，置于冰上备用。

b.准备RNA样品：根据投入量和样品浓度，计算RNA取样体积，用Nuclease Free H2O稀释至10 μL。

c.按照表4于200 μL PCR管中配制rRNA去除反应体系。

表4 探针杂交反应体系

名称	体积 (μL)
Hybridization Buffer	3
Human Probe Mix (rRNA & ITS/ETS)	2
Total RNA	10 (100 ng~1 μg)
Total	15

d.使用移液器轻轻吹打混匀，瞬离将反应液离心至管底。

e.将上述 PCR 管置于PCR仪（可设置梯度降温）中，按照表5所示反应程序，进行探针杂交反应。

表5 探针杂交反应程序

温度	时间
热盖105℃	On
95℃	2 min
95℃-22℃	0.1℃/s
22℃	5 min
4℃	hold

2)RNase H消化

a.将RNase H消化试剂从-20 ℃取出，解冻后颠倒混匀，置于冰上备用。按照表 6 所示，配制RNase H消化反应体系。

表6 RNase H消化反应体系

名称	体积 (μL)
RNase H Buffer	3
RNase H	2
上步产物	15
Total	20

b.使用移液器轻轻吹打混匀，瞬离将反应液离心至管底。

c.将上述 PCR 管置于PCR仪中，设置反应程序：热盖50℃；37℃，30 min；4℃，hold，进行RNase H消化反应。

3)DNase I 消化

a.将DNase I消化试剂从-20 ℃ 取出，解冻后颠倒混匀，置于冰上备用。按照表7所示，配制DNase I消化反应体系。

表7 DNase I消化反应体系

名称	体积 (μL)
DNase I Buffer	27.5
DNase I	2.5
上一步产物	20
Total	50

b. 使用移液器轻轻吹打混匀，瞬离将反应液离心至管底。

c. 将上述 PCR 管置于PCR仪中，设置反应程序：热盖50℃；37℃，30min； 4℃，hold，进行DNase I消化反应。

4）RNA纯化

a.准备工作：将 Hieff NGS® RNA Cleaner (Yeasen Cat#12602)磁珠由冰箱中取出，室温平衡至少 30 min。用Nuclease Free H2O配制 80%乙醇。

b.涡旋振荡或充分颠倒磁珠以保证充分混匀。

c.吸取 110 μL Hieff NGS® RNA Cleaner (2.2×，Beads:DNA=2.2:1)至上一步产物中，移液器充分吹打混匀，室温孵育 5 min。

d.将PCR管置于磁力架中分离磁珠和液体，待溶液澄清后（约5 min），小心移除上清。

e.保持PCR管始终置于磁力架中，加入 200 μL Nuclease free H2O新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠，室温孵育 30 sec 后，小心移除上清。

f.重复步骤e，总计漂洗两次。用 10 μL移液器吸干净残留液体。

g.保持 PCR 管始终置于磁力架中，室温下开盖干燥磁珠 (5~10 min)。

h.RNA洗脱：将PCR 管从磁力架上取下，衔接本产品，加入18.5 μL Frag/Prime buffer，使用移液器轻轻吹打至充分混匀，室温静置 5 min。

i.将 PCR管短暂离心并置于磁力架中静置，待溶液澄清后（约3 min），小心移取17 μL 上清至新的Nuclease free PCR 管中，进行RNA片段化。

g.RNA片段化条件需根据样本质量进行调整，高质量的RNA样本，片段化条件可参考mRNA片段化条件（表3）。表8推荐了FFPE不同质量样本的片段化条件。但不同的样本片段化效果会存在一定的差异，客户可根据自己的样本情况，做不同片段化条件对比，选择合适的片段化条件。

k.片段化结束请立即置于冰上，进入一链合成反应（Part II-步骤1)。

表8 FFPE RNA片段化条件推荐

DV200*	片段化程序
>70%	94℃, 7 min，4℃，hold；
50%~70%	94℃, 5 min，4℃，hold；
20%~50%	85℃, 8 min，4℃，hold；
<20%（风险建库）	65℃, 8 min，4℃，hold；

*降解RNA的样本质量使用DV200指标判断，详见附录三说明

Part II：Illumina&MGI平台RNA文库构建

1.第一链cDNA的合成 (1st Strand Synthesis)

该步骤将已经富集/片段化的目标RNA合成一链cDNA。目标RNA的富集可根据实验需求和样本情况选择Poly(A) mRNA isolation方案或rRNA Depletion方案，详见Part I。

将一链合成试剂提前从-20℃取出，吹吸混匀后，按表9所示，加入第一链cDNA合成的反应液。

表9 第一链cDNA合成反应体系

名称	体积 (μL)
Frag/Prime Buffer with Fragmented RNA	17
1st Reaction Module 2.0	8
Total	25

2）使用移液器轻轻吹打混匀，瞬离将反应液离心至管底。

3）将上述PCR管置于PCR仪中，按照表10所示设置反应程序，进行第一链cDNA的合成。反应结束后立即进行第二链cDNA的合成。

表10 第一链cDNA合成反应程序

温度	时间
热盖 105℃	On
25℃	10 min
42℃	15 min
70℃	15 min
4℃	Hold

2.第二链cDNA的合成/末端修复/加A (2nd Strand Synthesis/dA-Tailing)

1）将二链合成试剂提前从-20℃取出，吹吸混匀后，按照表11所示，加入第二链cDNA合成/末端修复/加A反应液。

表11 第二链cDNA合成反应体系

名称	体积 (μL)
1st Strand cDNA	25
2nd Reaction Module (dUTP)*	35
Total	60

【注】：*本试剂盒是构建的链特异性 mRNA 文库，如需构建普通 mRNA 文库，请使用Yeasen Cat#12341。

2）使用移液器轻轻吹打混匀，瞬离将反应液离心至管底。

3）将上述PCR管置于PCR仪中，按照表12所示设置反应程序，进行第二链cDNA的合成。

表12 第二链cDNA合成反应程序

温度	时间
热盖 105℃	on
16℃	30 min
72℃	15 min
4℃	Hold

3.接头连接 (Adapter Ligation)

该步骤可在末端修复和dA尾添加的产物末端，连接特定的Illumina®或MGI®接头。

1）参考注意事项二中的表1，根据Input RNA量，稀释Adapter至合适浓度。

2）将接头连接试剂提前从-20℃取出，吹吸混匀后，按表13所示，加入接头连接反应体系。

表13 Adapter Ligation体系

名称	体积 (μL)
dA-tailed DNA	60
Ligation Reaction Module	35*
DNA Adapter	5**
Total	100

【注】：*Ligation Reaction Module较黏稠，请充分混匀并瞬时离心后使用。

**本公司Illumina®接头原始浓度为15 μM, MGI®接头原始浓度为10 μM，请根据注意事项二表1的提示，根据投入量对接头进行稀释，使接头添加体积固定为5 μL

3）使用移液器轻轻吹打混匀，并短暂离心将反应液收集至管底。

4）将PCR管置于PCR仪中，设置表14所示反应程序，进行接头连接反应。

表14 Adapter Ligation反应程序

温度	时间
热盖	Off
20℃	15 min
4℃	Hold

4.连接产物纯化 (Post Ligation Clean Up)

本方案适用于片段＜200 bp时，通过两次纯化去除体系中的接头残留；当插入片段≥200 bp时，参照附录二的分选方案，通过纯化、分选获得目标长度的文库。

适用于插入片段<200 bp的文库（需进行两轮纯化）

1）准备工作：将Hieff NGS® DNA Selection Beads磁珠由冰箱中取出，室温平衡至少30 min。配制80%乙醇。

2）涡旋振荡或充分颠倒磁珠以保证充分混匀。

3）吸取60μL Hieff NGS® DNA Selection Beads (0.6×，Beads:DNA=0.6:1)至Adapter Ligation产物中，涡旋或吹打混匀，室温孵育5 min。

4）将PCR管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体，待溶液澄清后（约5 min），小心移除上清。

5）保持PCR管始终置于磁力架中，加入200 μL新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠，室温孵育30 sec后，小心移除上清。

6）重复步骤5，总计漂洗两次。

7）保持PCR管始终置于磁力架中，开盖空气干燥磁珠至刚刚出现龟裂（不超过5 min）。

8）将PCR管从磁力架中取出，加入52 μL ddH2O，涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打至充分混匀，室温静置5 min。将PCR管短暂离心并置于磁力架中静置，待溶液澄清后（约3 min），小心移取50 μL上清至新PCR管中，再进行一轮纯化。

9）吸取40 μL Hieff NGS® DNA Selection Beads (0.8×，Beads:DNA=0.8:1)至上一步产物中，涡旋或吹打混匀，室温孵育5 min。

10）将PCR管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体，待溶液澄清后（约3 min），小心移除上清。

11）保持PCR管始终置于磁力架中，加入200 μL新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠，室温孵育30 sec后，小心移除上清。

12）重复步骤11，总计漂洗两次。

13）保持PCR管始终置于磁力架中，开盖空气干燥磁珠至刚刚出现龟裂（不超过5 min）。

14）将PCR管从磁力架中取出，加入21 μL ddH2O，涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打至充分混匀，室温静置5 min。将PCR管短暂离心并置于磁力架中静置，待溶液澄清后（约3 min），小心移取20 μL上清至新PCR管中，进行PCR扩增。

5.文库扩增 (Library Amplification)

该步骤将对纯化或长度分选后的接头连接产物进行PCR扩增富集。

将扩增试剂提前从-20℃取出，吹吸混匀后，按照表15所示，加入扩增反应试剂。

表15-A IIIumina短接头连接产物PCR反应体系表15-B IIIumina长接头连接产物PCR反应体系

组分名称	体积 (μL)	组分名称	体积 (μL)
2×Super Canace® II High-Fidelity Mix	25	2×Super Canace® II High-Fidelity Mix	25
Universal Primer/ i5 Primer*	2.5	Primer Mix**	5
Index Primer/ i7 Primer*	2.5	Primer Mix**	5
Adapter Ligated DNA	20	Adapter Ligated DNA	20
Total	50	Total	50

【注】：*如果使用的是无Index的接头，俗称短接头（小Y接头），请使用短接头试剂 (Cat#12414-12415)中配备的Index primer进行扩增。**如果您使用的是Indexed Adapter (Cat#13519~Cat#13520)，俗称长接头（大Y接头），可用Cat#13335中的Hieff NGS® Primer Mix for Illumina®进行扩增。

表15-C MGI长接头连接产物PCR反应体系

组分名称	体积（μL）
2×Super Canace® II High-Fidelity Mix	25
Primer Mix for MGI®*	5
Adapter Ligated DNA	20

【注】：*该primer mix for MGI不含在本试剂盒中，可用Cat#13334中的Hieff NGS® Primer Mix for MGI®进行扩增。

2）使用移液器轻轻吹打或振荡混匀，并短暂离心将反应液收集至管底。

3）将PCR管置于PCR仪中，设置表16所示反应程序，进行PCR扩增。

表16 PCR扩增反应程序

温度	时间	循环数
98℃	1 min	1
98℃	10 sec	11~16 cycles*
60℃	30 sec
72℃	30 sec
72℃	5 min	1
4℃	Hold	-

【注】：*文库扩增循环数需根据样本质量、投入量等建库条件进行调整，详见注意事项三。

6.扩增产物磁珠纯化 (Post Amplification Clean Up)

1）准备工作：将Hieff NGS® DNA Selection Beads磁珠由冰箱中取出，室温平衡至少30 min。配制80%乙醇。

2）涡旋振荡或充分颠倒磁珠以保证充分混匀。

3）吸取45 μL Hieff NGS® DNA Selection Beads (0.9×，Beads:DNA=0.9:1)至扩增产物中，涡旋或吹打混匀，室温孵育5 min。

4）将PCR管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体，待溶液澄清后（约5 min），小心移除上清。

5）保持PCR管始终置于磁力架中，加入200 μL新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠，室温孵育30 sec后，小心移除上清。

6）重复步骤5，总计漂洗两次。

7）保持PCR管始终置于磁力架中，开盖空气干燥磁珠至刚刚出现龟裂（不超过5 min）。

8）将PCR管从磁力架中取出，加入21 μL ddH2O，涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打至充分混匀，室温静置5 min。将PCR管短暂离心并置于磁力架中静置，待溶液澄清后（约3 min），小心移取20 μL上清至新PCR管中，进行文库定量、质检。

7.文库质量控制

通常情况下，构建好的文库可通过浓度检测和长度分布检测来进行质量评价，具体请参见注意事项五。

附录

附录一：mRNA片段化效果展示

图2. mRNA不同打断时间

mRNA不同打断时间对应的RNA片段范围。分别以94°C，10 min、94°C，7min和94℃，5 min处理。打断后mRNA进行进行2.2X 磁珠纯化，通过Agilent 2100 Bioanalyzer进行检测。

【注】：本结果使用的RNA是Agilent公司的Universal Human Reference RNA，若使用其他来源的RNA，最好优化打断时间。

附录二：Illumina平台的分选条件说明

分选方案适用于94°C，10 min、94°C，7min和94℃，5 min片段化的RNA建库，可以获得插入片段大于200 bp的文库：

方案一：接头连接产物纯化后分选

1.0.6X Hieff NGS® DNA Selection Beads接头连接产物的纯化

1）准备工作：将Hieff NGS® DNA Selection Beads磁珠由冰箱中取出，室温平衡至少30 min。配制80%乙醇。

2）涡旋振荡或充分颠倒磁珠以保证充分混匀。

3）吸取60μL Hieff NGS® DNA Selection Beads (0.6×，Beads:DNA=0.6:1)至Adapter Ligation产物中，涡旋或吹打混匀，室温孵育5 min。

4）将PCR管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体，待溶液澄清后（约5 min），小心移除上清。

5）保持PCR管始终置于磁力架中，加入200 μL新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠，室温孵育30 sec后，小心移除上清。

6）重复步骤5，总计漂洗两次。

7）保持PCR管始终置于磁力架中，开盖空气干燥磁珠至刚刚出现龟裂（不超过5 min）。

8）将PCR管从磁力架中取出，加入102 μL ddH2O，涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打至充分混匀，室温静置5 min。将PCR管短暂离心并置于磁力架中静置，待溶液澄清后（约5 min），小心移取100 μL上清至新PCR管中，准备进行双轮分选。

双轮分选（以94°C，7min打断，分选文库大小为410bp~510bp为例说明，其他文库大小按推荐比例进行磁珠分选）当选择短接头（小Y接头）进行连接后纯化，使用双端384种 Index Primers: Hieff NGS® RNA 384 CDI Primer Kit for Illumina® , Set 1~Set 2 (Cat#12414~Cat#12415)进行RNA建库时，分选比例参照表17进行，当选择长接头（大Y接头），使用Indexed Adapters: Hieff NGS® Complete Adapter Kit for Illumina®, Set 1~Set 2(Cat#13519~Cat#13520)进行连接后纯化，分选比例参照表18进行。

2.0.65X /0.15X Hieff NGS® DNA Selection Beads接头连接产物的分选

1）请涡旋振荡或充分颠倒磁珠以保证混匀。

2）根据DNA片段长度要求，参考表17，在上述100 μL DNA中加入第一轮分选磁珠65 μL (0.65×)，涡旋或移液器吹打10次混匀。

3）室温孵育5 min。

4）将PCR管短暂离心并置于磁力架中，待溶液澄清后（约5 min），小心转移上清到干净的离心管中，残留1-2 μL溶液管底。

5）参考表17向上清中加入第二轮分选磁珠15 μL (0.15×)。

6）涡旋混匀或移液器吹打10次混匀，室温静置5 min。

7）将PCR管短暂离心并置于磁力架中，待溶液澄清后（约3 min），小心移除上清。

8）保持PCR管始终处于磁力架中，加入200 μL新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠，室温孵育30 sec，小心移除上清。

9）重复步骤8。

10）保持PCR管始终处于磁力架中，开盖干燥磁珠至刚刚出现龟裂（约3 min）。

11）将PCR管从磁力架中取出，加入21 μL ddH2O，涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打充分混匀，室温静置5 min。

12）将PCR管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体。待溶液澄清后（约3 min），小心转移20 μL上清至干净管中。

表17 短接头文库分选推荐磁珠比例

插入片段长度 (bp)	200~300	250~350	350~450	450~550
文库长度 (bp)	260~360	310~410	410~510	510~610
打断条件	94℃ 10 min	94℃ 7 min	94℃ 7 min	94℃ 5 min
第一轮磁珠体积(μL)	80 (0.8×)	75 (0.75×)	65 (0.65×)	60 (0.6×)
第二轮磁珠体积 (μL)	15 (0.15×)	15 (0.15×)	15 (0.15×)	10 (0.1×)

表18 长接头文库分选推荐磁珠比例

插入片段长度 (bp)	200~300	250~350	350~450	450~550
文库长度 (bp)	320~420	370~470	470~570	570~670
打断条件	94℃ 10 min	94℃ 7 min	94℃ 7 min	94℃ 5 min
第一轮磁珠体积(μL)	75 (0.75×)	70 (0.7×)	65 (0.65×)	60 (0.6×)
第二轮磁珠体积 (μL)	15 (0.15×)	15 (0.15×)	15 (0.15×)	10 (0.1×)

【注】：表17、18推荐的双轮分选比例适用于Hieff NGS® DNA Selection Beads；表中“×”表示样品DNA体积。如所需文库插入片段主峰为300 bp时，若在短接头连接之后分选，样品DNA体积为100 μL，则第一轮分选磁珠使用体积为0.65×100 μL=65 μL，第二轮分选磁珠使用体积为0.15×100 μL=15 μL；若在长接头连接之后分选，样品DNA体积为100 μL，则第一轮分选磁珠使用体积为0.65×100 μL=65 μL，第二轮分选磁珠使用体积为0.15×100 μL=15 μL。

图3不同片段化条件文库峰型

1 μg 293 total RNA，在94°C，10 min、94°C，7 min和94℃，5 min片段化后，根据表17推荐的磁珠比例得到的文库大小。

方案二：接头连接产物直接分选

以94°C，7 min打断，分选文库大小为410 bp~510 bp为例说明，其他文库大小按推荐比例进行磁珠分选。

500 ng以上的总RNA做mRNA抓取后建库，推荐直接分选，体系比较粘稠，需要小心添加，RNA质量略差样本可能会有接头残留。

当选择短接头（小Y接头）进行连接后纯化，使用双端384种 Index Primers: Hieff NGS® RNA 384 CDI Primer Kit for Illumina® , Set 1~Set 2 (Cat#12414-12415)进行RNA建库时，分选比例参照表19进行，当选择长接头（大Y接头），使用Indexed Adapters:Hieff NGS® Complete Adapter Kit for Illumina®, Set 1~Set 2(Cat#13519~Cat#13520)进行连接后纯化，分选比例参照表20进行。

1. 请涡旋振荡或充分颠倒磁珠以保证混匀。

2. 根据DNA片段长度要求，参考表19，在上述100 μL的连接体系中加入第一轮分选磁珠20 μL (0.20×)，涡旋或移液器吹打10次混匀。室温孵育10 min。

3. 将PCR管短暂离心并置于磁力架中，待溶液澄清后（约5 min），小心转移 100 μL上清到干净的离心管中，。

4. 参考表19向上清中加入第二轮分选磁珠10 μL (0.10×)。

5. 涡旋混匀或移液器吹打10次混匀，室温静置10 min。

6. 将PCR管短暂离心并置于磁力架中，待溶液澄清后（约3 min），小心移除上清。

7. 保持PCR管始终处于磁力架中，加入200 μL新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠，室温孵育30 sec，小心移除上清。

8. 重复步骤7。

9. 保持PCR管始终处于磁力架中，开盖干燥磁珠至刚刚出现龟裂（约3 min）。

10. 将PCR管从磁力架中取出，加入21 μL ddH2O，涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打充分混匀，室温静置5 min。

11. 将PCR管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体。待溶液澄清后（约3 min），小心转移20 μL上清至干净管中。

表19 短接头文库分选推荐磁珠比例

插入片段长度 (bp）	200~300	250~350	350~450	450~550
文库长度 (bp)	260~360	310~410	410~510	510~610
打断条件	94℃ 10 min	94℃ 7 min	94℃ 7 min	94℃ 5 min
第一轮磁珠体积(μL)	25 (0.25×)	25 (0.25×)	20 (0.2×)	18 (0.18×)
第二轮磁珠体积 (μL)	10 (0.1×)	10 (0.1×)	10 (0.1×)	10 (0.1×)

表20 长接头文库分选推荐磁珠比例

插入片段长度 (bp)	200~300	250~350	350~450	450~550
文库长度 (bp)	320~420	370~470	470~570	570~670
打断条件	94℃ 10 min	94℃ 7 min	94℃ 7 min	94℃ 5 min
第一轮磁珠体积(μL)	25 (0.25×)	20 (0.2×)	18 (0.18×)	18 (0.18×)
第二轮磁珠体积 (μL)	10 (0.1×)	10 (0.1×)	10 (0.1×)	10 (0.1×)

图4.不同分选比例文库峰型

1 μg 293 total RNA，在94°C，10 min、94°C，7min和94℃，5 min片段化后，根据表19推荐的磁珠比例得到的文库大小。

附录三：MGI平台分选条件说明

分选方案适用于94°C，10 min、94°C，7 min和94℃，5 min片段化的RNA建库，可以获得插入片段大于200 bp的文库：

方案一：接头连接产物纯化后分选

1.0.6× Hieff NGS® DNA Selection Beads接头连接产物的纯化

1）准备工作：将Hieff NGS® DNA Selection Beads磁珠由冰箱中取出，室温平衡至少30 min。配制80%乙醇。

2）涡旋振荡或充分颠倒磁珠以保证充分混匀。

3）吸取60 μL Hieff NGS® DNA Selection Beads（0.6×，Beads:DNA=0.6:1）至Adapter Ligation产物中，涡旋或吹打混匀，室温孵育5 min。

4）将PCR管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体，待溶液澄清后（约5 min），小心移除上清。

5）保持PCR管始终置于磁力架中，加入200 μL新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠，室温孵育30 sec后，小心移除上清。

6）重复步骤5，总计漂洗两次。

7）保持PCR管始终置于磁力架中，开盖空气干燥磁珠至刚刚出现龟裂（不超过5 min）。

8）将PCR管从磁力架中取出，加入102 μL ddH2O，涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打至充分混匀，室温静置5 min。将PCR管短暂离心并置于磁力架中静置，待溶液澄清后（约5 min），小心移取100μL上清至新PCR管中，准备进行双轮分选。

【注】：Ligation Enhancer中含有的高浓度PEG会对磁珠双轮分选产生影响，所以必须经过一轮纯化后再进行双轮分选。

双轮分选

以94°C，7 min打断，分选文库大小为380 bp~480 bp为例说明，其他文库大小按推荐比例进行磁珠分选。

1）请涡旋振荡或充分颠倒磁珠以保证混匀。

2）根据DNA片段长度要求，参考表21，在上述100 μL DNA中加入第一轮分选磁珠65 μL(0.65×），涡旋或移液器吹打10次混匀。

【注】：此表推荐的双轮分选比例适用于Hieff NGS® DNA Selection Beads；表中“×”表示样品DNA体积。如所需文库插入片段主峰为300 bp时，若在短接头连接之后分选，样品DNA体积为100 μL，则第一轮分选磁珠使用体积为0.65×100 μL=65 μL，第二轮分选磁珠使用体积为0.15×100 μL=15 μL。

3）室温孵育5 min。

4）将PCR管短暂离心并置于磁力架中，待溶液澄清后（约5 min），小心转移上清到干净的离心管中，残留1-2 μL溶液管底。

5）参考表21向上清中加入第二轮分选磁珠15 μL(0.15×）。

6）涡旋混匀或移液器吹打10次混匀，室温静置5 min。

7）将PCR管短暂离心并置于磁力架中，待溶液澄清后（约3 min），小心移除上清。

8）保持PCR管始终处于磁力架中，加入200 μL新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠，室温孵育30 sec，小心移除上清。

9）重复步骤8。

10）保持PCR管始终处于磁力架中，开盖干燥磁珠至刚刚出现龟裂（约3 min）。

11）将PCR管从磁力架中取出，加入21 μL ddH2O，涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打充分混匀，室温静置5 min。

12）将PCR管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体。待溶液澄清后（约3 min），小心转移20 μL上清至干净管中。

表21 短接头文库分选推荐磁珠比例

插入片段长度（bp）	200~300	300~400	400~500	500~600
文库长度（bp）	280~380	380~480	480~580	580~680
打断条件	94℃ 10 min	94℃ 7 min	94℃ 7 min	94℃ 5 min
第一轮磁珠体积(μl)	70（0.7×）	65（0.65×）	58（0.58×）	50（0.5×）
第二轮磁珠体积 (μl)	20（0.2×）	15（0.15×）	15（0.15×）	15（0.15×）

图5.不同分选比例文库峰型

1 μg 293 total RNA，在94°C，10 min、94°C，7 min和94℃，5 min片段化后，根据表21推荐的磁珠比例得到的文库大小。

方案二：接头连接产物直接分选（以94°C，7 min打断，分选文库大小为410 bp~510 bp为例说明，其他文库大小按推荐比例进行磁珠分选）

500 ng以上的总RNA做mRNA抓取后建库，推荐直接分选，体系比较粘稠，需要小心添加，RNA质量略差样本可能会有接头残留。

1. 请涡旋振荡或充分颠倒磁珠以保证混匀。

2. 根据DNA片段长度要求，参考表22，的连接体系中加入第一轮分选磁珠20 μL(0.20×），涡旋或移液器吹打10次混匀。室温孵育10 min。

【注】：此表推荐的双轮分选比例适用于Hieff NGS® DNA Selection Beads；表中“×”表示样品DNA体积。如所需文库插入片段主峰为300 bp时，若在短接头连接之后分选，样品DNA体积为100 μL，则第一轮分选磁珠使用体积为0.20×100 μL=20 μL，第二轮分选磁珠使用体积为0.1×100 μL=10 μL。

3. 将PCR管短暂离心并置于磁力架中，待溶液澄清后（约5 min），小心转移 100 μL上清到干净的离心管中，。

4. 参考表22向上清中加入第二轮分选磁珠10 μL(0.10×）。

5. 涡旋混匀或移液器吹打10次混匀，室温静置10 min。

6. 将PCR管短暂离心并置于磁力架中，待溶液澄清后（约3 min），小心移除上清。

7. 保持PCR管始终处于磁力架中，加入200 μL新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠，室温孵育30 sec，小心移除上清。

8. 重复步骤7。

9. 保持PCR管始终处于磁力架中，开盖干燥磁珠至刚刚出现龟裂（约3 min）。

10. 将PCR管从磁力架中取出，加入21 μL ddH2O，涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打充分混匀，室温静置5 min。

11. 将PCR管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体。待溶液澄清后（约3 min），小心转移20 μL上清至干净管中。

表22 短接头文库分选推荐磁珠比例

插入片段长度（bp）	200~300	300~400	400~500	500~600
文库长度（bp）	280~380	380~480	480~580	580~680
打断条件	94℃ 10 min	94℃ 7 min	94℃ 7 min	94℃ 5 min
第一轮磁珠体积(μl)	25（0.25×）	20（0.2×）	15（0.15×）	15（0.15×）
第二轮磁珠体积 (μl)	10（0.1×）	10（0.1×）	10（0.1×）	10（0.1×）

附录四：FFPE样本建库说明

1. FFPE RNA质量评价

rRNA去除建库方案可用于FFPE等低质量的Total RNA 样本，但由于不同FFPE样本的质量差距较大，需要根据样本情况调整建库条件。常规评价 RNA 样本质量的参数是 RIN 值，但是对于 FFPE 这种降解的样本，并不能完全用 RIN 值来准确衡量样本的质量，此时还需要用到 DV200指标。DV200 表示样本中大于 200 nt的 RNA 片段所占的比例，对于降解严重的 FFPE 样本，DV200值能够更好的反应样本的质量。

DV200计算方法如下：

图6.DV200占比

在一个检测完成的 Agilent 2100 Bioanalyzer 结果图中，在 Local 下选择 Advanced勾选 Smear Analysis 下的 Perform Smear Analysis 选项，选择Region Table页面，鼠标右击，选择Add Region调整指示线的范围即可得到所选片段范围所占的比例 % of Total。

2. FFPE RNA建库示例

表23展示了不同质量FFPE样本在不同建库条件下的文库分布，以供参考。对于降解严重的FFPE RNA (DV200<50%)和起始量低的文库构建，我们推荐接头连接后采用两次纯化方案，以减少文库损失。

表23 不同质量的FFPE文库峰型

RNA样本质控	建库条件	文库分布质控
RIN=2.2; DV200=74% RIN=2.2; DV200=74%	投入量：500 ng 片段化条件：94℃，7 min 接头连接后进行两次纯化：0.6×；0.8× 链特异建库扩增：12 cycles 文库产量：717.2 ng
	投入量：500 ng 片段化条件：94℃，7 min 接头连接后进行纯化/分选：0.6×；07×/0.15× 链特异建库扩增：13 cycles 文库产量：437.8 ng
	投入量：100 ng 片段化条件：94℃，7 min 接头连接后进行两次纯化：0.6×；0.8× 链特异建库扩增：15 cycles 文库产量： 206.8 ng
RIN=2.5; DV200=26%	投入量：500 ng 片段化条件：85℃，8 min 接头连接后进行两次纯化：0.6×；0.8× 链特异建库扩增：12 cycles 文库产量：207 ng
RIN=2.5; DV200=26%	投入量：500 ng 片段化条件：85℃，8 min 接头连接后进行纯化、分选：0.6×；0.70×/0.15× 链特异建库扩增：13 cycles 文库产量：98.56 ng
RIN=2.5; DV200=11%	投入量：500 ng 片段化条件：65℃，8 min 接头连接后进行两次纯化：0.6×；0.8× 链特异建库扩增：12 cycles 文库产量：354.2 ng
RIN=2.5; DV200=11%	投入量：500 ng 片段化条件：65℃，8 min 接头连接后进行两次纯化：0.6×；0.70×/0.15× 链特异建库扩增：13 cycles 文库产量：172.48 ng