一代测序二代测序三代测序的区别与应用

引言

自1977年第一代测序技术诞生以来，DNA测序技术已走过近五十年的发展历程。从人类基因组计划的十年鏖战，到如今单个基因组测序仅需数小时，测序技术的每一次革新都在拓展科学的疆域，重新定义我们对生命、健康与演化的认知。

如今，一代测序（Sanger测序）、二代测序（NGS）、三代测序（TGS） 三“代”同堂，各有拥趸，各有千秋。面对不同的研究目标——是验证一个位点，还是扫描整个基因组？是组装一个复杂的基因组，还是检测低频突变？

今天，我们从产品经理的视角，带您理清三代测序技术的核心差异、适用场景及实验方案，助您在面对不同问题时，选对“那把钥匙”。

 

图1 测序技术发展时间线（图源网络 侵删）

 

一、 背景介绍：三代测序，三代“兵法”

第一代：Sanger测序——测序界的“金标准”

第一代测序技术基于Sanger双脱氧终止法原理，结合荧光标记和毛细管电泳技术实现自动化测序。它的核心优势是读长长（可达800-1000 bp）、准确度极高（99.999%），至今仍是测序界的“金标准”。

优点：准确度无可撼动，是临床确认的“终审法官”。

局限：通量低、成本高，无法满足大规模测序需求。

图2  Sanger测序原理图（图源网络 侵删）

 

 

 

第二代：NGS测序——高通量的“主力军”

第二代测序技术（如Illumina的SBS技术、华大的DNBSEQ技术）实现了大规模并行测序，一次运行可产生海量数据，极大降低了单位碱基的测序成本。它使得以前需要三年完成的人类基因组测序，缩短至一周以内。

优点：通量高、成本低，适合大规模筛查和群体研究。

局限：读长短（通常35-300 bp），在重复序列区域、结构变异检测方面存在盲区。

 

图3  Illumina二代测序仪（图源网络 侵删）

 

第三代：单分子测序——破解“暗物质”的利器

第三代测序技术（如PacBio的SMRT测序、Oxford Nanopore的纳米孔测序）的核心特征是单分子测序，无需PCR扩增，可直接读取单条DNA分子的序列。其最大优势是读长极长（可达数十kb甚至Mb级），能够跨越基因组中的复杂重复区域。

优点：超长读长、无PCR偏好、可直接检测碱基修饰（如甲基化）。

局限：单次准确率较NGS低（需通过测序深度校正）、成本较高

 

图4  纳米孔测序原理（图源网络 侵删）

 

图5  PacBio测序原理（图源网络 侵删）

 

 

 

二、 技术应用：三代测序的“十八般武艺”

第一代测序应用场景

1、位点验证：对NGS发现的候选位点进行Sanger验证，是临床检测的标准流程。

2、单基因/片段测序：如特定致病基因的片段测序、质粒构建后验证、微生物16S rRNA单克隆测序等。

3、低通量项目：仅需检测少数几个基因的小规模研究。

 

图6  Sanger测序实验流程（图源网络 侵删）

第二代测序应用场景

1、全基因组/全外显子测序：大规模人群队列研究、罕见病致病基因筛查。

2、靶向Panel测序：肿瘤多基因伴随诊断、遗传病热点突变筛查。

3、转录组测序：基因表达定量分析、可变剪接研究（短读长足以覆盖大部分转录本）。

4、微生物组研究：16S rRNA扩增子测序、宏基因组测序

 

第三代测序应用场景

1、基因组De novo组装：超长读长可跨越重复序列和复杂结构区域，大幅提升基因组组装的连续性和完整度。

2、结构变异检测：精准识别大片段插入、缺失、倒位、易位等结构变异，这是NGS的短板。

3、全长转录本测序：直接获取全长mRNA/cDNA序列，精准鉴定异构体，解析复杂剪接模式。

4、碱基修饰直接检测：PacBio和Nanopore平台均可直接检测DNA甲基化等修饰，无需Bisulfite转化。

5、实时病原体监测：三代测序速度快（Nanopore可在测序的同时进行数据分析），适用于疫情暴发时的病原体快速鉴定。

 

三、 常见实验方案：三代测序工作流对比

测序代次	建库核心流程	测序平台举例	关键质控点
第一代	PCR扩增目标片段 → 纯化 → 测序反应（含ddNTP）→ 毛细管电泳	3730XL系列	模板纯度、引物特异性、峰图质量
第一代	DNA片段化 → 末端修复/加A → 接头连接 → PCR扩增 → 上机测序（桥式PCR或DNB纳米球）	Illumina系列、华大DNBSEQ系列	片段分布、文库浓度、接头二聚体
第一代	无需PCR扩增（或仅需少量扩增）→ 连接环状接头（PacBio）或直接加接头上机（Nanopore）→ 单分子实时测序	PacBio Sequel、Oxford Nanopore GridION	DNA大片段完整性、起始量、文库摩尔浓度

 

 

四、 进阶思路：如何让“三代”协同作战？

在实际应用中，“三代同堂”并非相互取代，而是互补协同。

NGS+Sanger：NGS大规模筛查发现候选变异，Sanger验证确认。

TGS+NGS：三代测序组装高质量参考基因组或检测结构变异，二代测序进行群体规模的变异分型和定量分析。

TGS+（NGS+Sanger）：在临床诊断中，可用三代测序覆盖复杂区域（如HLA分型、CYP2D6等高度同源区域），二代测序做常规筛查，Sanger验证关键位点。

 

【翌圣DNA建库系列产品选购指南】

 

 

【翌圣RNA建库系列产品选购指南】

RNA建库系列	试剂盒	主要应用	搭配接头
			Illumina测序仪	MGI测序仪
mRNA抓取	12629ES	真核生物mRNA抓取	若后续搭配建库试剂盒， 管式双端index接头：12412~12413 板式双端index接头：12327~12331 Illumina&MGI通用磷酸化接头：12323	若后续搭配建库试剂盒， 管式单端index接头：13362 板式双端index接头：13350~13353 Illumina&MGI通用磷酸化接头：12323
核糖体去除	12254ES	植物rRNA去除
	12257ES	人/小鼠/大鼠rRNA去除
	12806ES	Globin去除探针
	13572ES	Globin去除试剂盒
	12265ES	原核生物rRNA去除
	12258ES	3 min快速去除（人）
非预混建库试剂盒	12309ES	常规mRNA建库试剂盒	管式双端index接头：12412~12413 板式双端index接头：12327~12331 Illumina&MGI通用磷酸化接头：12323	管式单端index接头：13362 板式双端index接头：13350~13353 Illumina&MGI通用磷酸化接头：12323
	12308ES	常规lncRNA建库试剂盒
预混/板式建库试剂盒	12340ES	常规TotalRNA建库试剂盒，lncRNA建库
	12341ES	常规TotalRNA建库试剂盒，mRNA建库

 

【翌圣三代建库产品选择指南】

 

产品类别	产品名称	货号
连接法建库	Hieff® DNA Library Prep Kit for ONT	13301ES
末修加A模块	Hieff® DNA Endprep&dA-Tail Module for ONT	13302ES
Barcode接头连接模块	Hieff® DNA Endprep&dA-Tail Module for ONT	13303ES
马达蛋白接头连接模块	Hieff ® Adapter Ligation Module for ONT	13304ES
片段化/末修/加A模块	Hieff ® Adapter Ligation Module for ONT	13309ES
长片段高保真扩增酶	Hieff NGS® Multiplex Long PCR Master Mix	17228ES
配套建库产品	Hieff NGS® DNA Selection Beads 分选磁珠(完美替代AMPure XPBeads)	12601ES
	1×dsDNA HS Assay Kit	12642ES