在分子诊断实验室的日常工作中，地中海贫血（Thalassemia，简称"地贫"）的基因检测堪称一项"经典挑战"。作为全球最常见的单基因遗传病之一，地贫在我国南方地区携带率高达11%~24% 。然而，当我们面对那些PCR结果与电泳表型"对不上"的疑难样本，或是产前诊断中遇到的罕见缺失型突变时，传统的Gap-PCR和Sanger测序往往显得力不从心。近年来，以PacBio SMRT和Oxford Nanopore（ONT）为代表的三代测序（Third-Generation Sequencing, TGS）技术，正在重塑地贫的分子诊断格局。它不再满足于"读取"基因片段，而是试图“看清”整个珠蛋白基因簇的全貌。

一、地贫检测：为什么需要"更长"的读长？

地中海贫血主要分为α-地贫和β-地贫，分别由HBA基因簇（16p13.3）和HBB基因簇（11p15.5）的突变所致，这两个区域堪称基因组中的"技术雷区"。

①　区域高度同源：α珠蛋白基因的HBA1和HBA2同源性高达97%以上，常规短读长测序难以区分。

②　高GC含量：珠蛋白基因调控区GC含量极高，二代测序（NGS）扩增偏好明显。

③　复杂结构变异：从常见的--SEA、-α3.7缺失，到罕见的几十kb甚至上百kb的大片段缺失、倒位、重复，突变类型层出不穷。

④　假基因干扰：HBBP1等假基因与功能基因高度相似，极易造成误判。

⑤　传统PCR-RDB（反向点杂交）只能检测预设的已知突变；Gap-PCR对引物设计依赖度极高；而NGS虽然通量高，但其150~300 bp的短读长在面对上述复杂区域时，往往如同"用碎片拼图"——拼得出单核苷酸变异（SNV），却难以精准定位结构变异的断裂点，更无法区分顺式/反式排列。

二、两种技术路线的"长臂"

目前地贫检测领域应用的三代测序主要包括两大平台，PacBio SMRT（单分子实时测序）和Oxford Nanopore（纳米孔测序）。PacBio 其核心在于"滚动环式自我校正"（CCS）。通过将DNA分子环化后进行多次滚环测序，当深度达到10×时，CCS读长准确率可达99.9%以上。读长通常在10~30 kb，足以覆盖整个HBA或HBB基因簇。ONT的亮点在于超长读长与实时测序。其最长读长可达30~40万碱基，且设备便携（MinION仅重约100克）。通过检测DNA单链穿过纳米孔时的电流变化，直接读取碱基序列。

两种技术路线各有侧重：PacBio以高精度CCS见长，适合临床诊断级别的精准分型；ONT以超长读长和灵活通量取胜，在科研探索和快速筛查中潜力更大。

图1 基于Nanopore的三代测序（TGS）完整工作流程（图片来源：网，侵删）

三、三代测序在地贫诊断中的四大"破局点"

3.1覆盖更全面：一步式检测多种变异类型

传统方法通常采用不同的技术平台分别检测缺失型和点突变，而三代测序可在单次检测中同步识别单核苷酸变异（SNV）、缺失和复杂结构变异。目前获批的α和β地中海贫血基因检测试剂盒（单分子测序法），基于CATSA技术和SMRT HiFi模式，可实现地贫所有变异类型“一步式”检测，覆盖α-珠蛋白基因的4种缺失、3种点突变及β-珠蛋白基因的16种点突变，搭载经30万例样本验证的AI数据分析平台。

3.2准确性高：大量临床研究证实性能

基于纳米孔测序的研究，利用国家基因组DNA参考物质评估了其检测地贫变异的表现。研究对36份样本进行分析，成功鉴定出19个SNV、6个缺失和2个三体变异，所有变异均与参考物质基因型100%一致，既没有假阳性也没有假阴性[1]。

3.3发现新变异：破解罕见漏诊困局

三代测序在罕见变异的发现方面展现出独特优势。南方医科大学徐湘民教授团队利用优化的靶向长读长测序（T-LRS）panel，对1020名β-地贫患者进行了大规模队列研究，不仅进行了精准的基因型检测，还成功构建了珠蛋白基因簇的单倍型，并发现了与血红蛋白F表达相关的198个变异[2]。

3.4从携带者筛查到产前诊断：三代测序的多元应用场景

携带者筛查：精准锁定生育风险。对于有生育计划的夫妇而言，三代测序可在孕前准确评估双方的地贫基因携带状态，为遗传咨询提供可靠的依据。产前诊断：突破传统侵入性检测的局限，将三代（长读长）测序技术开创性地应用于地贫产前诊断。胚胎植入前遗传学检测：从源头阻断地贫。某公司研发的“胚胎植入前地中海贫血基因检测试剂盒（半导体测序法）”正式获批上市。可对胚胎的囊胚滋养层细胞样本及其父母和亲属的全血样本进行检测。通过连锁分析判断胚胎是否遗传了α-地贫或β-地贫相关基因突变，帮助医生筛选健康胚胎植入，从源头阻断地贫遗传链条。

四、三代测序检测的实验流程

以纳米孔测序为代表的三代测序在地贫检测中的典型实验流程包括以下几个关键步骤：

①　样本采集与核酸提取：采集外周静脉全血，提取高质量的基因组DNA，确保DNA完整性以支持长片段扩增。

②　靶向扩增：针对α-珠蛋白基因簇和β-珠蛋白基因簇设计特异性的长片段PCR引物，通过多重PCR或长距离PCR扩增目标区域。

③　文库构建：对扩增产物进行末端修复，连接测序接头，构建适合三代测序平台的文库。

④　上机测序：将文库加载到测序仪上进行测序，通过单分子实时监测或纳米孔电流变化识别碱基序列。

⑤　数据分析和结果解读：测序数据经质控后与参考基因组比对，识别各种变异类型。通过生物信息学分析进行基因型判定，并结合血常规和血红蛋白电泳结果综合解读。

五、展望

从短读长到长读长，从已知突变筛查到全谱变异解析，三代测序为地中海贫血的分子诊断打开了一扇新的窗。它让我们第一次能够"从头到尾"读完一段珠蛋白基因的故事，看清那些曾经被模糊处理的断裂点、重复和重排。对于实验室工作者来说，这不仅是技术平台的迭代，更是一种思维方式的转变——“检测预设的靶点"走向"发现真实的基因组”。

参考文献

[1] Wei X, Yang X, Han W, et al. Applying the National Genomic DNA Reference Materials to Evaluate the Performance of Nanopore Sequencing in Identifying Thalassemia Variants. J Clin Lab Anal. 2025 Jun;39(11):e70044.

[2] Y.Ye, C.Niu, A.Mao, et al. Haplotype-Resolved Genotyping and Association Analysis of 1,020 β-Thalassemia Patients by Targeted Long-Read Sequencing. Adv. Sci.2025, 12, 2410992

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