三代测序在血型基因检测中的应用

红细胞血型系统的精准鉴定是输血安全的核心基石。然而，常规的血清学方法在遇到ABO亚型、嵌合体血型、弱表达抗原等疑难样本时，往往出现正反定型不符、抗原抗体反应微弱等问题，难以给出明确结论。传统分子分型技术如PCR-SSP或Sanger测序虽可在一定程度上补充血清学结果，但其读长有限，通常只能靶向外显子区域，难以覆盖基因全长调控区、内含子及复杂结构变异区域，更无法解析单倍型信息和嵌合体基因型。

第三代测序技术的兴起为这一困境带来了突破性解决方案。以PacBio单分子实时测序和Oxford Nanopore纳米孔测序为代表的三代测序技术，凭借超长读长和无需PCR扩增的特性，实现了单条DNA分子的直接测序。其长读长优势使得基因全长测序成为可能，能够一次性覆盖外显子、内含子乃至启动子区域，突破了传统技术在复杂结构变异、嵌合体分析和新等位基因发现中的技术瓶颈。

图1 三代测序技术原理（来源： Public Library of Bioinformatics）

传统测序方法在分析ABO血型系统时面临一个核心难题：ABO基因存在与GBGT1基因同源重组的假基因干扰，且部分亚型突变位于内含子或非编码调控区，常规外显子测序难以覆盖。三代测序通过单分子长读长测序，能够完整读取整个ABO基因（含侧翼调控区），实现对复杂结构变异和单倍型的高分辨率解析。

三代测序在单倍型相位解析方面具有天然优势。PacBio SMRT测序技术可在单条长读长上直接捕获同一染色体上的多个变异位点，从而精确构建单倍型，而非依赖统计推断。

三代测序的发现力远超传统手段。2026年3月，南昌市中心血站利用三代长读长测序技术，首次在ABO基因启动子区域发现c.1-66G>T单碱基突变，确证其为A3亚型的遗传基础，将ABO亚型的分子证据从传统编码区延伸至调控区。此前，该团队还曾在全球首次报道FUT1基因新突变（类孟买B型），充分彰显了三代测序在罕见新等位基因发现中的不可替代性。

对于血清学正反定型不符的疑难样本，三代测序已成为精准分型的利器。一篇针对17例ABO血型定型出现混合视野的样本的研究显示，利用PacBio三代测序技术鉴定出A1Bweak 5例、cisAB 2例、Bweak 1例及B(A) 1例。徐州市血液中心通过整合传统PCR-SSP技术与三代测序，建立了高效的ABO亚型检测流程，2025年上半年即成功鉴定出2例罕见ABO亚型，相关成果已投稿至《Transfusion》杂志。

Rh血型系统因RHD和RHCE基因高度同源，存在复杂的基因重组和缺失变异，传统方法难以精准解析。一项针对罕见Dc−变异个体的研究中，研究者利用PacBio三代测序技术检测RHCE、RHD和RHAG的基因全长序列，成功鉴定出RHCE∗02N.08和新型等位基因RHCE-D(5-9)-CE的组合，揭示了表型异常的分子机制。

Kidd血型系统由SLC14A1基因编码，常规高通量供体基因分型与血清学结果之间时有矛盾。Gueuning等人采用Nanopore长读长测序，对11,972名供体数据中10例无法解释的冲突结果进行了系统性解析。结果显示：5例与已知的弱等位基因和无效等位基因有关，2例鉴定出JK∗01和JK∗02单倍型上的新型无效等位基因，另有3例涉及一个此前未知的约5kb大片段缺失（跨越外显子9-10），其他分子方法均未能检出。该研究表明，Nanopore测序在检测单核苷酸变异和结构变异方面均表现出可靠且精准的性能，特别适用于杂合基因、缺失和重复等复杂结构变异的解析。

类孟买血型因FUT1基因突变导致H抗原缺乏，在输血中具有重要临床意义。Wang等人回顾性分析了91,874例癌症患者的血型结果，利用PacBio单分子实时测序鉴定出8例类孟买血型，明确了FUT1基因型和FUT2基因型分布，并在ABO基因第7外显子发现了一个新型杂合突变818C>T（经PacBio测序定位于O单倍型）。PacBio测序技术在分析类孟买血型基因单倍型方面展现出显著优势，为癌症患者的精准输血建立了可靠的鉴定体系。

三代测序应用于血型基因检测的实验流程主要包括两大技术路线，实验室可根据检测需求和样本规模进行选择。

该方案适用于常见血型系统的快速检测，尤其适合特定基因（如ABO、RHCE）的靶向分析。核心流程包括：从全血或口腔拭子中提取高分子量基因组DNA（要求DNA完整性>30kb、浓度≥30 ng/μL、总量≥1 μg）；设计跨全长基因或核心外显子区域的LR-PCR引物（扩增子大小通常在2.4-15.8 kbp范围内）进行长片段扩增；使用连接法建库试剂盒进行文库制备和barcode标记；在PacBio或Nanopore平台上完成测序；通过生物信息学与血型等位基因数据库比对，完成完整基因分型和单倍型解析。该方案的显著优势是靶向性强、覆盖高，能够确保目标基因获得充分的测序深度。

该方案适用于全血型系统同步分析的复杂场景，尤其适合RHD/MNS等存在复杂结构变异和嵌合等位基因的系统。其核心是利用Nanopore平台的Adaptive Sampling功能进行靶向富集测序——无需PCR扩增，直接对全基因组DNA进行测序，系统实时比对目标区域并选择性剔除非目标序列，从而高效富集全血型基因组区域。已有研究在单个PromethION流式细胞上实现了2个样本多重测序，生成37.0-52.4 Gb数据，平均靶向覆盖度达到18.9×-53.4×，成功解析了所有可疑杂合等位基因。该方案的最大优势是无需定制多重PCR引物即可同时分析数十个血型系统，特别适合血型发现和稀有血型筛查。

值得一提的是，Oxford Nanopore已有临床优化的快速实验方案，优化后的nanopore测序流程可在7小时内完成从DNA提取到血型基因分型的全流程，适合免疫血液学病例研究中的单样本或少量样本快速检测。

图2 基因检测全流程（来源：潘道生物科技）

三代测序技术在血型基因检测中的应用，已经实现了从“外显子局部扫描”到“基因全长全景解析”的跨越式进步。其超长读长、单倍型直接解析、高灵敏度检测结构变异等独特优势，使其在疑难ABO亚型鉴定、Rh系统复杂变异分析、嵌合体血型鉴别、罕见新等位基因发现等场景中展现出无可替代的价值。国内研究团队在这一领域已积累了丰富的SCI和核心期刊论文成果，多地血液中心也已将三代测序纳入常规疑难血型鉴定工作流程。

展望未来，随着三代测序的成本持续下降和实验流程的不断优化，其在血型基因检测中的规模化应用前景广阔。尤其是国产纳米孔测序平台的崛起——以深圳血液中心联合浙江大学、浙江血液中心等机构基于国产PolyseqOne平台发现CD36基因新型大片段缺失为代表，国产长读长测序平台的成熟应用正加速推进血型基因组学的自主创新和临床转化。

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