HEK293 Host Cell Residue DNA Size Analysis Kit HEK293宿主细胞残留DNA片段分析试剂盒

更多活动更多优惠,尽在翌圣商城》

批量采购, 请点击询价

产品说明书

FAQ

COA

已发表文献

 

HEK293宿主细胞残留DNA片段分析试剂盒是用于定量分析检测各种生物制品的中间品、半成品和成品中不同长度的HEK293残留DNA含量的试剂盒。

本试剂盒采用qPCR荧光探针原理,专一快速检测200 bp以下及以上的HEK293 DNA残留,其定量限可以达到10 fg/μL水平且配套有HEK293 DNA Control(DNA定量参考品)。该试剂盒可与本公司的磁珠法残留DNA样本前处理试剂盒(Cat#18461ES/18462ES)配套使用。

 

组分信息

组分编号

组分名称

41316ES70

41316ES74

41316-A

HEK293 qPCR Mix

0.75 mL×4

1.5 mL×4管

41316-B1

HEK293 Primer&Probe Mix-82

250 μL×1管

500 μL×1管

41316-B2

HEK293 Primer&Probe Mix-133

250 μL×1管

500 μL×1管

41316-B3

HEK293 Primer&Probe Mix-227

250 μL×1管

500 μL×1管

41316-B4

HEK293 Primer&Probe Mix-515

250 μL×1管

500 μL×1管

41316-C

DNA Dilution Buffer

1.8 mL×2管

1.8 mL×4管

41316-D

HEK293 DNA Control(30 ng/μL)

25 μL×1管

50 μL×1管

 

储存条件

1. 所有组分均干冰运输,-25~-15℃保存,有效期2年其中A组分B1、B2、B3、B4组分需避光保存。

2. 收到货后,请检查共7个组分是否齐全,并立即放入对应的保存温度中储存。

 

注意事项

1. 本产品仅作科研用途

2. 为了您的安全和健康,请穿实验服并佩戴一次性手套操作。

3. 使用本试剂前请仔细阅读本说明书,实验应规范操作,包括样本处理、反应体系的配制及加样。

4. 每个组分在使用前都应充分震荡混匀,低速离心。

 

适用机型

包含但不限于以下仪器:

Thermo Scientific:ABI 7500,ABI Quant Studio 5,ABI Step OnePlus;

Bio-Rad:CFX96 Optic Module;

上海宏石医疗科技:SLAN-96S。

 

使用说明

1. HEK293 DNA Control定量参考品的稀释和标准曲线的制备

HEK293片段分析试剂盒中含有四种不同长度的扩增片段分别为:82 bp、133 bp、227 bp、515 bp。在建立标曲时,需分别对不同的扩增片段设置标曲,并根据对应扩增片段的标曲来计算其残留量和分布相对量。

用试剂盒中提供的DNA Dilution Buffer(DNA稀释液)将HEK293 DNA Control定量参考品进行梯度稀释*,稀释浓度依次为3 ng/μL、300 pg/μL、30 pg/μL、3 pg/μL、300 fg/μL、30 fg/μL。

具体操作如下:

1将试剂盒中HEK293 DNA Control和DNA Dilution Buffer置于冰上融化,待完全融化,轻微振荡混匀,低速离心10 sec。

26支洁净的1.5 mL离心管,分别标记为Std0Std1Std2Std3Std4Std5。

3)在标记为Std0的1.5 mL离心管中加90 μL DNA Dilution Buffer和10 μL HEK293 DNA Control,即稀释为3 ng/μL,振荡混匀后低速离心10 sec,该浓度可分装置于-20℃短期保存(不超过3个月)**,使用时避免反复冻融。

4)在Std0Std1Std2Std3Std4Std5离心管中先分别加入90 μL DNA Dilution Buffer***,再进行梯度稀释****具体稀释方法如下:

稀释管

稀释比例

终浓度

Std1

10 μL Std0 + 90 μL DNA Dilution Buffer

300 pg/μL

Std2

10 μL Std1 + 90 μL DNA Dilution Buffer

30 pg/μL

Std3

10 μL Std2 + 90 μL DNA Dilution Buffer

3 pg/μL

Std4

10 μL Std3 + 90 μL DNA Dilution Buffer

300 fg/μL

Std5

10 μL Std4 + 90 μL DNA Dilution Buffer

30 fg/μL

1 标准品梯度稀释

*每个浓度做3个复孔,该试剂可测试300 pg/μL-30 fg/μL线性范围。若需要,可适当扩大或缩小线性范围。

**为减少反复冻融次数和避免污染,建议初次使用时将DNA定量参考品分装储存于-20℃。

***已融化未使用的DNA稀释液可保存于2-8℃ 7天,若长时间不用,请放置于-20℃。

****为确保模板完全混匀,每个梯度稀释时需轻微震荡混匀约1 min。

2. 待测样本TS的制备

根据实验设置待测样本TS,具体操作如下:

1100 μL待测样本加入1.5 mL净的离心管中,标记为TS,进行样本前处理,制备待测样本TS纯化液。

2)为了满足同步进行四个不同扩增长度的片段分析检测需求,前处理后的待测样品量需≥120 μL,因此建议每个样品同时准备2管进行前处理,提取完成后混匀使用。

3. 阴性抽提质控NCS的制备

根据实验设置阴性抽提质控NCS,具体操作如下:

1100 μL样本基质溶液(或DNA稀释液)加入1.5 mL净的离心管中,标记为NCS

2阴性质控NCS和同批待测样本一起进行样本前处理,制备成阴性质控NCS纯化液。

3)为了满足同步进行四个不同扩增长度的片段分析检测需求,前处理后的NCS样品量需≥120 μL,因此建议每个样品同时准备2管进行前处理,提取完成后混匀使用。

4. 无模板对照NTC的制备

根据实验设置无模板对照NTC,具体操作如下:

1无模板对照NTC无需进行样本前处理,qPCR法检测残留DNA含量阶段开始配置即可。

2每管或孔中NTC样本20 μL Mix混合液(即15 μL HEK293 qPCR Mix + 5μL对应HEK293 Primer&Probe Mix+ 10 μL DNA Dilution Buffer建议配置3个重复孔的量

5. 反应体系

82 bp反应体系

体积(μL)

HEK293 qPCR Mix*

15

HEK293 Primer&Probe Mix-82

5

DNA Template**

10

总体积***

30

 

2 82 bp扩增片段的反应体系

133 bp反应体系

体积(μL)

HEK293 qPCR Mix*

15

HEK293 Primer&Probe Mix-133

5

DNA Template**

10

总体积***

30

 

3 133 bp扩增片段的反应体系

227 bp反应体系

体积(μL)

HEK293 qPCR Mix*

15

HEK293 Primer&Probe Mix-227

5

DNA Template**

10

总体积***

30

 

4 227 bp扩增片段的反应体系

515 bp反应体系

体积(μL)

HEK293 qPCR Mix*

15

HEK293 Primer&Probe Mix-515

5

DNA Template**

10

总体积***

30

 

5 515 bp扩增片段的反应体系

*根据反应孔数计算本次所需的Mix混合液总量:Mix混合液=(反应孔数+2)× (15+5) μL(含有2孔的损失量)。通常,每个样本做3个重复孔。

**反应孔数=(5个浓度梯度的标准曲线+1个无模板对照NTC+1个阴性抽提质控NCS+N个待测样TS)× 3。

NTC (No Template Control):DNA Dilution Buffer

NCS (Negative Control Solution):样本基质溶液或DNA Dilution Buffer进行样本前处理后,所得纯化液为NCS

TS (Test Sample):待测样本

***加样完成密封好管子后,请低速离心10 sec将管壁的液体离心收集至管底,再震荡混匀5 sec以上,完全混匀反应液,再低速离心10 sec将管壁的液体离心收集至管底,如有气泡,需将气泡排尽。

为参考板位:

 

82 bp

133 bp

227 bp

515 bp

 

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

A

Std1

Std1

Std1

Std1

Std1

Std1

Std1

Std1

Std1

Std1

Std1

Std1

B

Std2

Std2

Std2

Std2

Std2

Std2

Std2

Std2

Std2

Std2

Std2

Std2

C

Std3

Std3

Std3

Std3

Std3

Std3

Std3

Std3

Std3

Std3

Std3

Std3

D

Std4

Std4

Std4

Std4

Std4

Std4

Std4

Std4

Std4

Std4

Std4

Std4

E

Std5

Std5

Std5

Std5

Std5

Std5

Std5

Std5

Std5

Std5

Std5

Std5

F

TS

TS

TS

TS

TS

TS

TS

TS

TS

TS

TS

TS

G

NCS

NCS

NCS

NCS

NCS

NCS

NCS

NCS

NCS

NCS

NCS

NCS

H

NTC

NTC

NTC

NTC

NTC

NTC

NTC

NTC

NTC

NTC

NTC

NTC

6 上机参考板位

该示例是对HEK293残留DNA各扩增片段分析的qPCR法检测操作的展示,检测样本包括:5个浓度梯度的HEK293 DNA标准曲线、1个待测样本TS、1个阴性质控NCS、1个无模板对照NTC。建议每个样本做3个重复孔。

6. 扩增程序参数设置(两步法)(以ABI公司7500 qPCR仪、软件版本2.0为例)

1创建空白新程序,选择绝对定量检测模板。

2针对四种不同长度扩增片段创建新检测探针分别命名为HEK293-82HEK293-133HEK293-227HEK293-515”,选择报告荧光基团为“FAM”,猝灭荧光基团为“none”检测参比荧光为ROX”(参比荧光可根据仪器型号等情况,选择是否需要添加)。

3“Assign target (s) to the selected wells”面板中,将标准曲线孔“Task”一栏设置为“Standard”,并且在“Quantity”一栏分别赋值为“300000”“30000”“3000”“300”“30”(含义为每孔的DNA浓度,单位为fg/μL),并且在相应的“Sample Name”一栏中命名为“300 pg/μL”“30 pg/μL”“3 pg/μL”“300 fg/μL”“30 fg/μL”;将无模板对照NTC孔的“Task”一栏设置为“NTC”;将阴性质控NCS孔、待测样本TS孔的“Task”一栏设置为“Unknown”,并且在相应的“Sample Name”一栏中分别命名为“NCS”、“TS”,之后点击“Start Run”,开始仪器运行。

4扩增程序设置:设置三步法扩增程序,反应体积30 μL。

循环步骤

温度(℃)

时间

循环数

污染消化

37℃

5 min

1

预变性

95℃

5 min

1

变性

95℃

15 sec

45

退火

60℃

30 sec

延伸(收集荧光)

72℃

30 sec

7 扩增程序

7. qPCR结果分析

1“Analysis”的“Amplification Plot”面板中,系统会自动给出“Threshold”,有时系统给出的“Threshold”离基线太近,导致复孔之间Ct相差甚远,可手动调节“Threshold”至合适位置,点击“Analyze”。此时可在“Multicomponent Plot”初步查看扩增曲线的形态是否正常。

2“Analysis”的“Standard Curve”面板中,可读取标准曲线的R²、扩增效率(Eff%)、斜率(Slope)、截距(Intercept)等。正常的标曲:R²>0.99,扩增效率在90%≤Eff%≤110%范围内,Slope在-3.6~-3.1。

3“Analysis”的“View well table”面板中,“Quantity”一栏可读取无模板对照NTC、阴性质控NCS、待测样本TS,单位为fg/μL,后续可在检测报告中进行单位换算。

4结果分析的参数设置需依据具体的机型及使用的软件版本,一般也可由仪器自动判读。

5阴性质控NCS的Ct值应大于标曲最低浓度Ct的均值。

6无模板对照NTC的检测结果应为Undetermined或Ct值≥32。

 

Ver.CN20230515

400-6111-883