E.coli宿主细胞DNA残留检测试剂盒是用于定量分析检测各种生物制品的中间品、半成品和成品中的E.coli残留DNA含量的试剂盒。

本试剂盒采用探针法荧光定量PCR原理，可专一快速的检测E.coli细胞的残留DNA，其最低检测限可以达到fg水平。该试剂盒可与本公司的磁珠法残留DNA样本前处理试剂盒(Cat#18461ES/18462ES)配套使用。

 

产品组分

组分编号	组分名称	产品编号/规格
		41308ES50 (50T)	41308ES60 (100T)
41308-A	E.coli qPCR Mix	0.75 mL	1.5 mL
41308-B	E.coli Primer&Probe Mix	250 μL	500 μL
41308-C	DNA Dilution Buffer	2×1.8 mL	4×1.8 mL
41308-D	E.coli DNA Control (30 ng/μL)	25 μL	50 μL

 

运输和保存方法

1. 所有组分均干冰运输，-20℃保存，有效期2年。且41308-A和41308-B均需避光保存。

2. 收到货后，请检查共4个组分是否齐全，并立即放入对应的保存温度中储存。

 

注意事项

1. 使用本试剂前请仔细阅读本说明书，实验应规范操作，包括样本处理、反应体系的配制及加样。

2. 每个组分在使用前都应充分震荡混匀，低速离心。

3. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

4. 本产品仅作科研用途。

 

适用机型

包含但不限于以下仪器：

Bio-Rad：CFX96 Optic Module；

Thermo Scientific：ABI 7500，ABI Quant Studio 5，ABI Step OnePlus；

上海宏石医疗科技：SLAN-96S。

 

使用方法

一、E.coli DNA定量参考品的稀释和标准曲线的制备

用试剂盒中提供的DNA稀释液将DNA定量参考品进行梯度稀释，稀释浓度依次为300 pg/μL，30 pg/μL，3 pg/μL，300 fg/μL，30 fg/μL。

具体操作如下：

1. 将试剂盒中的E.coli DNA Control和DNA Dilution Buffer置于冰上融化，待完全融化后，轻微振荡混匀，低速离心10 sec。

2. 取6支洁净的1.5 mL离心管，分别标记为Std0，Std1，Std2，Std3，Std4，Std5。

3. 在标记为Std0的1.5 mL离心管中加入90 μL DNA Dilution Buffer和10 μL E.coli DNA Control (30 ng/μL)，即稀释为3 ng/μL，振荡混匀后短暂快速离心10 sec，该浓度可分装置于-20℃短期保存（不超过3个月），使用时避免反复冻融。

4. 在Std1，Std2，Std3，Std4，Std5管中先分别加入90 μL DNA Dilution Buffer，再进行梯度稀释，稀释方法如下：

稀释管	稀释比例	终浓度
Std1	10 μL Std0 + 90 μL DNA Dilution Buffer	300 pg/μL
Std2	10 μL Std1 + 90 μL DNA Dilution Buffer	30 pg/μL
Std3	10 μL Std2 + 90 μL DNA Dilution Buffer	3 pg/μL
Std4	10 μL Std3 + 90 μL DNA Dilution Buffer	300 fg/μL
Std5	10 μL Std4 + 90 μL DNA Dilution Buffer	30 fg/μL

【注】：

1. 每个浓度做3个复孔，该试剂可测试30 fg/μL-300 pg/μL线性范围。若需要，可适当扩大或缩小线性范围。

2. 为减少反复冻融次数和避免污染，建议初次使用时将DNA定量参考品分装储存于-20℃。

3. 已融化未使用的DNA Dilution Buffer可保存于2-8℃ 7天，若长时间不用，请放置于-20℃。

4. 为确保模板完全混匀，每个梯度稀释时需轻微震荡混匀约1 min。

 

二、样本加标回收质控ERC的制备

根据需要设置ERC中的E.coli DNA标准品浓度（以制备加30 pg E.coli DNA量的ERC为例），具体操作如下：

1. 取100 μL待测样本加入1.5 mL洁净的离心管中，再加入10 μL Std3，混匀，标记为ERC。

2. 加标回收ERC和同批待测样本一起进行样本前处理，制备加标回收ERC纯化液。

 

三、阴性抽提质控NCS的制备

根据实验设置阴性抽提质控NCS，具体操作如下：

1. 取100 μL样本基质溶液（或DNA Dilution Buffer）加入1.5 mL洁净的离心管中，标记为NCS。

2. 阴性质控NCS和同批待测样本一起进行样本前处理，制备成阴性质控NCS纯化液。

 

四、无模板对照NTC的制备

根据实验设置无模板对照NTC，具体操作如下：

1. 无模板对照NTC无需进行样本前处理，在qPCR法检测残留DNA含量阶段开始配置即可。

2. 每管或孔中的NTC样本为20 μL Mix混合液（即15 μL E.coli qPCR Mix + 5μL E.coli Primer&Probe Mix）+ 10 μL DNA Dilution Buffer，建议配置3个重复孔的量。

 

五、反应体系

组分	体积（μL）
E.coli qPCR Mix	15
E.coli Primer&Probe Mix	5
DNA template	10
总体积	30

【注】：

1.根据反应孔数计算本次所需的Mix混合液总量：Mix混合液=（反应孔数+2）× (15+5) μL（含有2孔的损失量）。通常，每个样本做3个重复孔。

2. 反应孔数=（5个浓度梯度的标准曲线+1个无模板对照NTC+1个阴性抽提质控NCS+待测样TS个数+待测样本对应加标回收ERC个数）× 3。

NTC (No Template Control)：DNA Dilution Buffer

NCS (Negative Control Solution)：样本基质溶液或DNA Dilution Buffer进行样本前处理后，所得纯化液为NCS

TS (Test Sample)：待测样本

ERC (Extraction Recovery Control)：待测样本中加入如30 pg标准品DNA后进行样本前处理，所得纯化液为加标回收ERC

3. 加样完成密封好管子后，请低速离心10 sec将管壁的液体离心收集至管底，再震荡混匀5 sec以上，完全混匀反应液，再低速离心10 sec将管壁的液体离心收集至管底，如有气泡，需将气泡排尽。

下图为参考板位：

该示例是对E.coli残留DNA qPCR法检测操作的展示，检测样本包括：5个浓度梯度的E.coli DNA标准曲线、1个无模板对照NTC、1个阴性质控NCS、3个待测样本TS、3个样本加标回收ERC。建议每个样本做3个重复孔。

 

六、扩增程序参数设置（两步法）（以ABI公司7500 qPCR仪、软件版本2.0为例）

1.创建空白新程序，选择绝对定量检测模板。

2.创建1个检测探针，命名为“E.coli-DNA”，选择报告荧光基团为“FAM”，猝灭荧光基团为“none”，参比荧光为“ROX”

（参比荧光可根据仪器型号等情况，选择是否需要添加）。

3.在“Assign target (s) to the selected wells”面板中，将标准曲线孔的“Task”一栏设置为“Standard”，并且在“Quantity”一栏分别赋值为“300000”，“30000”，“3000”，“300”，“30”（含义为每孔的DNA浓度，单位为fg/μL），并且在相应的“sample name”一栏中命名为“300 pg/μL”，“30 pg/μL”，“3 pg/μL”，“300 fg/μL”，“30 fg/μL”；将无模板对照NTC孔的“Task”一栏设置为“NTC”；将阴性质控NCS孔、待测样本TS孔、样本加标回收ERC孔的“Task”一栏设置为“Unknown”，并且在相应的“Sample Name”一栏中分别命名为“NCS”，“TS”，“ERC”；之后点击“Start Run”，开始仪器运行。

4. 扩增程序设置：设置反应体积30 μL。

循环步骤	温度（℃）	时间	循环数
预变性	95℃	10 min	1
变性	95℃	15 sec	40
退火/延伸（收集荧光）	60℃	30 sec

 

七、qPCR 结果分析

1.在“Analysis”的“Amplification Plot”面板中，系统会自动给出“Threshold”，有时系统给出的“Threshold”离基线太近，导致复孔之间Ct相差甚远，可手动调节“Threshold”至合适位置，点击“Analyze”。此时可在“Multicomponent Plot”初步查看扩增曲线的形态是否正常。

2. 在“Analysis”的“Standard Curve”面板中，可读取标准曲线的R²、扩增效率(Eff%)、斜率(Slope)、截距(Intercept)等。正常的标曲：R²>0.99，扩增效率在90%≤Eff%≤110%范围内，Slope在-3.6~-3.1。

3. 在“Analysis”的“View well table”面板中，“Quantity”一栏可读取无模板对照NTC、阴性质控NCS、待测样本TS、样本加标回收ERC的检测值，单位为fg/μL，后续可在检测报告中将单位换算成pg/μL或pg/mL。

4. 结果分析的参数设置需依据具体的机型及使用的软件版本，一般也可由仪器自动判读。

5. 根据待测样本TS和样本加标回收ERC的检测结果计算加标回收率，加标回收率要求在50%~150%之间。加标回收率计算公式：回收率(%) = {样本加标测定值(eg.pg/µL)-样本测定值(eg.pg/µL)} x洗脱体积(µL) / DNA加入量理论值(eg.pg) x 100%。

6. 阴性质控NCS的Ct值应大于标曲最低浓度Ct的均值。

7. 无模板对照NTC的检测结果应为Undetermined或Ct值≥35。

 

HB221130