CAR/TCR Copynumber Detection Kit CAR/TCR基因拷贝数检测试剂盒

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产品说明书

FAQ

COA

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产品简介

 

CAR/TCR基因拷贝数检测试剂盒适用于定量检测来源于HIV-1型慢病毒载体技术制备的人源细胞产品,如CAR-T或TCR-T细胞基因组中CAR或TCR基因的拷贝数。

CAR/TCR基因拷贝数检测试剂盒基于荧光探针定量PCR原理,采用多重qPCR方法分别检测转移质粒上与整合或表达功能相关的DNA序列和人体细胞中单拷贝基因(Single Copy Gene, SCG)的方法,计算得到样本中平均每个细胞的目的基因拷贝数,如CAR或TCR基因拷贝数水平。其定量限可以达到101 copies/μL水平。该试剂盒需要与本公司的磁珠法残留DNA样本前处理试剂盒(Cat#18461ES/18462ES)配套使用。

 

产品信息

 

货号

41313ES50 / 41313ES60

规格

50 T / 100 T

 

组分信息

 

组分编号

组分名称

41313ES50

41313ES60

41313-A

CAR/TCR qPCR Mix

0.75 mL

1.5 mL

41313-B

CAR/TCR Primer&probe Mix

200 μL

400 μL

41313-C

DNA Dilution Buffer

2×1.8 mL

4×1.8mL

41313-D

CAR/TCR DNA Control (2.1×108 copies/μL)

25 μL

50 μL

41313-E

IC*

50 μL

100 μL

*IC:Internal control,内部对照。

 

运输和储存条件

 

1. 所有组分均干冰运输,-25~-15℃保存,有效期2年。且41313-A和41313-B均需避光保存。

2. 收到货后,请检查共5个组分是否齐全,并立即放入对应的保存温度中储存。

 

适用机型

 

包含但不限于以下仪器:

Thermo Scientific:ABI 7500,ABI Quant Studio 5;

上海宏石医疗科技:SLAN-96S。

 

使用说明

 

  1. CAR/TCR DNA定量参考品的稀释和标准曲线的制备

CAR/TCR DNA定量参考品是同时含有CAR/TCR目的基因序列和SCG目的基因序列的质粒DNA,所以试剂盒的CAR/TCR DNA Control组分里,CAR/TCR和SCG的基因拷贝数是一样的。

用试剂盒中的DNA Dilution Buffer(DNA稀释液)将CAR/TCR DNA Control定量参考品进行梯度稀释*,稀释浓度依次为2.1×106 copies/μL、2.1×105 copies/μL、2.1×104 copies/μL、2.1×103 copies/μL、2.1×102 copies/μL。操作如下:

1)将试剂盒中CAR/TCR DNA Control和DNA Dilution Buffer置于室温融化,然后轻微振荡混匀,低速离心10 sec。

2)取6支干净的1.5 mL离心管,分别标记为Std0、Std1、Std2、Std3、Std4、Std5。

3)在标记Std0的1.5 mL管中加90 μL DNA Dilution Buffer和10 μL CAR/TCR DNA Control,即稀释为2.1×107 copies/μL,振荡混匀后短暂快速离心10 sec,该浓度可分装置于-25~-15℃短期保存(不超过6个月)**,使用时避免反复冻融。

4)在Std1、Std2、Std3、Std4、Std5管中先分别加入90 μL DNA Dilution Buffer***,再进行梯度稀释****,稀释方法如下:

稀释管

稀释比例

终浓度

CAR/TCR (copies/μL)

SCG (copies/μL)

Std1

10 μL Std0 + 90 μL DNA Dilution Buffer

2.1×106

2.1×106

Std2

10 μL Std1 + 90 μL DNA Dilution Buffer

2.1×105

2.1×105

Std3

10 μL Std2 + 90 μL DNA Dilution Buffer

2.1×104

2.1×104

Std4

10 μL Std3 + 90 μL DNA Dilution Buffer

2.1×103

2.1×103

Std5

10 μL Std4 + 90 μL DNA Dilution Buffer

2.1×102

2.1×102

1 标准品梯度稀释

*每个浓度做3个复孔,该试剂可测试2.1×106 copies/μL~2.1×102 copies/μL线性范围。若需要,可适当扩大或缩小线性范围。

**为减少反复冻融次数和避免污染,建议初次使用时将DNA定量参考品分装储存于-25~-15℃。

***已融化未使用的DNA Dilution Buffer可保存于2~8℃ 7天,若长时间不用,请放置于-25~-15℃。

****为确保模板完全混匀,每个梯度稀释时需轻微震荡混匀约1 min。

  1. 样本加标回收质控ERC的制备

根据需要设置ERC中CAR/TCR DNA标准品浓度(以制备加2.1×104 copies CAR/TCR DNA量的ERC为例),具体操作:

1) 取100 μL待测样本加入1.5 mL洁净的离心管中,再加入10 μL Std4,混匀,标记为ERC。

2) 加标回收ERC和同批待测样本一起进行样本前处理,制备加标回收ERC纯化液。

  1. 阴性抽提质控NCS的制备

根据实验设置阴性抽提质控NCS,具体操作如下:

1) 取100 μL样本基质溶液(或DNA Dilution Buffer)加入1.5 mL洁净的离心管中,标记为NCS。

2) 阴性质控NCS和同批待测样本一起进行样本前处理,制备成阴性质控NCS纯化液。

  1. 无模板对照NTC的制备

根据实验设置无模板对照NTC,具体操作如下:

1) 无模板对照NTC无需进行样本前处理,在qPCR法检测CAR/TCR DNA含量阶段开始配置即可。

2) 每管或孔中的NTC反应体系为20 μL Mix混合液(即15 μL CAR/TCR qPCR Mix + 4μL CAR/TCR Primer&Probe Mix+ 1μL IC)+ 10 μL DNA Dilution Buffer,建议配置3个重复孔的量。

  1. 反应体系

反应体系

体系(μL)

CAR/TCR qPCR Mix*

15

CAR/TCR Primer&probe Mix

4

IC

1

DNA template**

10

总体积***

30

2 标准品反应体系

*根据反应孔数计算本次所需的Mix混合液总量:Mix混合液=(反应孔数+2)×(15+4+1) μL(含有2孔的损失量)。通常,每个样本做3个重复孔。

**反应孔数=(5个浓度梯度的标准曲线+1个无模板对照NTC+1个阴性抽提质控NCS+待测样TS个数+待测样本对应加标回收ERC个数)×3

NTC (No Template Control):DNA Dilution Buffer

NCS (Negative Control Solution):样本基质溶液或DNA Dilution Buffer进行样本前处理,所得纯化液为NCS

TS (Test Sample):待测样本

ERC (Extraction Recovery Control):待测样本中加入如2.1×104 copies标准品DNA后进行样本前处理,所得纯化液为加标回收ERC

***加样完成密封好管子后,请低速离心10 sec将管壁的液体离心收集至管底,再震荡混匀5 sec以上,完全混匀反应液,再低速离心10 sec将管壁的液体离心收集至管底,如有气泡,需将气泡排尽。

下图为参考板位:

 

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

A

NTC

 

待测样本TS1

待测样本TS1

待测样本TS1

 

标准曲线Std1

标准曲线Std1

标准曲线Std1

 

 

 

B

NTC

 

待测样本TS2

待测样本TS2

待测样本TS2

 

标准曲线Std2

标准曲线Std2

标准曲线Std2

 

 

 

C

NTC

 

待测样本TS3

待测样本TS3

待测样本TS3

 

标准曲线Std3

标准曲线Std3

标准曲线Std3

 

 

 

D

 

 

 

 

 

 

标准曲线Std4

标准曲线Std4

标准曲线Std4

 

 

 

E

NCS

 

样本加标ERC1

样本加标ERC1

样本加标ERC1

 

标准曲线Std5

标准曲线Std5

标准曲线Std5

 

 

 

F

NCS

 

样本加标ERC2

样本加标ERC2

样本加标ERC2

 

 

 

 

 

 

 

G

NCS

 

样本加标ERC3

样本加标ERC3

样本加标ERC3

 

 

 

 

 

 

 

H

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

3 上机参考板位

该示例是对CAR/TCR基因拷贝数的qPCR法检测操作的展示,检测样本包括:5个浓度梯度的CAR/TCR DNA标准曲线、1个无模板对照NTC、1个阴性质控NCS、3个待测样本TS、3个样本加标回收ERC。建议每个样本做3个重复孔。

  1. 扩增程序参数设置(两步法)(以ABI公司7500 qPCR仪、软件版本2.0为例)

1)创建空白新程序,选择绝对定量检测模板。

2)创建2个检测探针,第一个命名为“CAR/TCR-DNA”,选择报告荧光基团为“FAM”,猝灭荧光基团为“None”;第二个命名为“SCG,选择报告荧光基团为“VIC”,猝灭荧光基团为“None”;再创建1个检测探针,命名为“IC”,选择报告荧光基团为“CY5”,猝灭荧光基团为“None”。参比荧光为ROX”(参比荧光可根据仪器型号等情况,选择是否需要添加;若选择ROX校准,建议阈值线选择0.06)。

3)在“Assign target (s) to the selected wells”面板中,将标准曲线孔的“Task”一栏设置为“Standard”,并且在“Quantity”一栏分别赋值为“2100000”、“210000”、“21000”、“2100”、“210”(含义为每孔的DNA浓度,单位为copies/μL),并且在相应的“sample name”一栏中命名为“2100000 copies/μL”、“210000 copies/μL”、“21000 copies/μL”、“2100 copies/μL”、“210 copies/μL”;将无模板对照NTC孔的“Task”一栏设置为“NTC”;将阴性质控NCS孔、待测样本TS孔、样本加标回收ERC孔“Task”一栏设置为“Unknown”,并且在相应的“Sample Name”一栏中分别命名为“NCS”、“TS”、“ERC”,之后点击“Start Run”,开始仪器运行。

4)扩增程序设置:设置反应体积30 μL。

循环步骤

温度(℃)

时间

循环数

污染消化

37℃

5 min

1

预变性

95℃

5 min

1

变性

95℃

15 sec

45

退火/延伸(收集荧光)

60℃

30 sec

4 扩增程序

 

  1. qPCR 结果分析

1)在“Analysis”的“Amplification Plot”面板中,系统会自动给出“Threshold”,有时系统给出的“Threshold”离基线太近,导致复孔之间Ct相差甚远,可手动调节“Threshold”至合适位置,点击“Analyze”。此时可在“Multicomponent Plot”初步查看扩增曲线的形态是否正常。

2)在“Analysis”的“Standard Curve”面板中,可读取标准曲线的R²、扩增效率(Eff%)、斜率(Slope)、截距(Intercept)等。正常的标曲:R²>0.99,扩增效率在90%≤Eff%≤110%范围内,Slope在-3.6~-3.1。

3)在“Analysis”的“View well table”面板中,“Quantity”一栏可读取无模板对照NTC、阴性质控NCS、待测样本TS、样本加标回收ERC的检测值,单位为copies/μL,后续可在检测报告中进行单位换算。

4)结果分析的参数设置需依据具体的机型及使用的软件版本,一般也可由仪器自动判读。

5)根据待测样本TS和样本加标回收ERC的检测结果计算加标回收率,加标回收率要求在50%~150%之间。加标回收率计算公式:回收率(%) = {样本加标测定值(eg.copies/µL)-样本测定值(eg.copies/µL)} x洗脱体积(µL) / DNA加入量理论值(eg.copies) x 100%。

6)阴性质控NCS的Ct值应为Undetermined或Ct值≥35。

7)无模板对照NTC的检测结果应为Undetermined或Ct值≥38。

8)每个细胞中的CAR或TCR拷贝数=

 

注意事项

 

1. 使用本试剂前请仔细阅读本说明书,实验应规范操作,包括样本处理、反应体系的配制及加样。

2. 每个组分在使用前都应充分震荡混匀,低速离心。

3. 为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。

4. 本产品仅作科研用途。

 

Ver.CN20231227

400-6111-883