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SV40LTA&E1A残留DNA检测试剂盒是用于定量分析检测生物制品中宿主细胞，如HEK293T细胞系中的SV40LTA和E1A残留DNA含量的试剂盒。
本试剂盒采用探针法荧光定量PCR原理，可专一快速的检测样品中SV40LTA和E1A残留DNA，其最低检测限可以达到101 copies/μL水平。该试剂盒可与本公司的磁珠法残留DNA样本前处理试剂盒(Cat#18461ES/18462ES)配套使用。
产品组分
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组分编号 |
组分名称 |
产品编号/规格 |
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41310ES50 (50T) |
41310ES60 (100T) |
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41310-A |
SV40LTA&E1A qPCR Mix |
0.75 mL |
1.5 mL |
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41310-B |
SV40LTA&E1A Primer&Probe Mix |
200 μL |
400 μL |
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41310-C |
DNA Dilution Buffer |
2×1.8 mL |
4×1.8 mL |
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41310-D |
SV40LTA&E1A DNA Control (nonliner) |
25 μL |
50 μL |
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41310-E |
SV40LTA&E1A DNA Control (linear) |
25 μL |
50 μL |
|
41310-F |
IC |
50 μL |
100 μL |
【注】：1. IC：Internal control，内部对照。
运输和保存方法
1. 所有组分均干冰运输，-25~-15℃保存，有效期2年。且41310-A和41310-B均需避光保存。
2. 收到货后，请检查共6个组分是否齐全，并立即放入对应的保存温度中储存。
注意事项
1. 使用本试剂前请仔细阅读本说明书，实验应规范操作，包括样本处理、反应体系的配制及加样。
2. 每个组分在使用前都应充分震荡混匀，低速离心。
3. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
4. 本产品仅作科研用途。
适用机型
包含但不限于以下仪器：
Bio-Rad：CFX96 Optic Module；
Thermo Scientific：ABI 7500，ABI Quant Studio 5，ABI Step OnePlus；
上海宏石医疗科技：SLAN-96S。
使用方法
一、SV40LTA&E1A DNA定量参考品的稀释和标准曲线的制备
已知，线性化和非线性化的SV40LTA&E1A DNA Control浓度都是一样的，且各自内含有的SV40LTA浓度均为1.8×107 copies/μL，E1A浓度均为1.8×107 copies/μL。建议根据实际样品结构特性，选择线性化或非线性化SV40LTA&E1A DNA Control配制标曲。具体操作如下：
1.将SV40LTA&E1A DNA Control和DNA Dilution Buffer置于冰上融化，待完全融化，轻微振荡混匀，低速离心10 sec。
2. 取6支干净的1.5 mL离心管，分别标记为Std0，Std1，Std2，Std3，Std4，Std5。
3. 在标记为Std0的1.5 mL离心管中加90 μL DNA Dilution Buffer和10 μL SV40LTA&E1A DNA Control，将SV40LTA&E1A定量参考品稀释10倍，得到Std0（SV40LTA浓度1.8×106 copies/μL，E1A浓度1.8×106 copies/μL），振荡混匀后短时间快速离心10 sec，该浓度可分装置于-20℃短期保存（不超过3个月），使用时避免反复冻融。
4. 在Std1，Std2，Std3，Std4，Std5管中先分别加入90 μL DNA Dilution Buffer，再进行梯度稀释，稀释方法如下：
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稀释管 |
稀释比例 |
终浓度(copies/μL) |
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SV40LTA (liner/nonliner) |
E1A (liner/nonliner) |
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Std1 |
10 μL Std0 + 90 μL DNA Dilution Buffer |
1.8×105 |
1.8×105 |
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Std2 |
10 μL Std1 + 90 μL DNA Dilution Buffer |
1.8×104 |
1.8×104 |
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Std3 |
10 μL Std2 + 90 μL DNA Dilution Buffer |
1.8×103 |
1.8×103 |
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Std4 |
10 μL Std3 + 90 μL DNA Dilution Buffer |
1.8×102 |
1.8×102 |
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Std5 |
10 μL Std4 + 90 μL DNA Dilution Buffer |
1.8×101 |
1.8×101 |
【注】：
1. 每个浓度做3个复孔，该试剂可测试1.8×101-1.8×105 copies/μL线性范围的SV40LTA和对应的1.8×101-1.8×105 copies/μL线性范围的E1A。
2. 为减少反复冻融次数和避免污染，建议初次使用时将DNA定量参考品分装储存于-20℃。
3. 已融化未使用的DNA Dilution Buffer可保存于2-8℃ 7天，若长时间不用，请放置于-20℃。
4. 为确保模板完全混匀，每个梯度稀释时需轻微震荡混匀约1 min。
二、样本加标回收质控ERC的制备
根据需要设置ERC中的SV40LTA&E1A DNA标准品浓度（以制备加1.8×103 copies SV40LTA对应1.8×103copies E1A DNA量的ERC为例），具体操作如下：
1. 取100 μL待测样本加入1.5 mL洁净的离心管中，再加入10 μL Std4，混匀，标记为ERC。
2. 加标回收ERC和同批待测样本一起进行样本前处理，制备加标回收ERC纯化液。
三、阴性抽提质控NCS的制备
根据实验设置阴性抽提质控NCS，具体操作如下：
1. 取100 μL样本基质溶液（或DNA Dilution Buffer）加入1.5 mL洁净的离心管中，标记为NCS。
2. 阴性质控NCS和同批待测样本一起进行样本前处理，制备成阴性质控NCS纯化液。
四、无模板对照NTC的制备
根据实验设置无模板对照NTC，具体操作如下：
1. 无模板对照NTC无需进行样本前处理，在qPCR法检测残留DNA含量阶段开始配置即可。
2. 每管或孔中的NTC反应体系为20 μL Mix混合液（即15 μL SV40LTA&E1A qPCR Mix + 4μL SV40LTA&E1A Primer&Probe Mix+ 1μL IC）+ 10 μL DNA Dilution Buffer，建议配置3个重复孔的量。
五、反应体系
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组分 |
体积(μL) |
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SV40LTA&E1A qPCR Mix |
15 |
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SV40LTA&E1A Primer&Probe Mix |
4 |
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IC |
1 |
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DNA template |
10 |
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总体积 |
30 |
【注】：
1.根据反应孔数计算本次所需Mix混合液总量：Mix混合液=（反应孔数+2）× (15+4+1) μL（含有2孔的损失量）。通常，每个样本做3个重复孔。
2. 反应孔数=（5个浓度梯度的标准曲线+1个无模板对照NTC+1个阴性抽提质控NCS+待测样本TS个数+待测样本对应加标回收ERC个数）× 3。
NTC (No Template Control)：DNA Dilution Buffer
NCS (Negative Control Solution)：样本基质溶液或DNA Dilution Buffer进行样本前处理后，所得纯化液为NCS
TS (Test Sample)：待测样本
ERC (Extraction Recovery Control)：待测样本中加入如1.8×103 copies SV40LTA对应1.8×103copies E1A标准品DNA后进行样本前处理，所得纯化液为加标回收ERC
3. 加样完成密封好管子后，请低速离心10 sec将管壁的液体离心收集至管底，再震荡混匀5 sec以上，完全混匀反应液，再低速离心10 sec将管壁的液体离心收集至管底，如有气泡，需将气泡排尽。
下图为参考板位：
该示例是对SV40LTA&E1A残留DNA qPCR法检测操作的展示，检测样本包括：5个浓度梯度SV40LTA&E1A DNA标准曲线、1个无模板对照NTC、1个阴性质控NCS、3个待测样本TS、3个样本加标回收ERC。建议每个样本做3个重复孔。
六、扩增程序参数设置（两步法）（以ABI公司7500 qPCR仪、软件版本2.4为例）
1.创建空白新程序，选择绝对定量检测模板。
2.创建2个检测探针，第一个命名为“SV40LTA-DNA”，选择报告荧光基团为“FAM”，猝灭荧光基团为“none”；第二个命名为“E1A-DNA”，选择报告荧光基团为“VIC”，猝灭荧光基团为“none”；再创建1个检测探针，命名为“IC”，选择报告荧光基团为“CY5”，猝灭荧光基团为“none”。参比荧光为“ROX”（参比荧光可根据仪器型号等情况，选择是否需要添加）。
3.在“Assign target (s) to the selected wells”面板中，将标准曲线孔“Task”一栏设置为“Standard”，并且在“Quantity”一栏分别赋值FAM通道“180000”，“18000”，“1800”，“180”，“18”，VIC通道“180000”，“18000”，“1800”，“180”，“18”（含义为每孔的DNA浓度，单位为copies/μL），并且在相应的“sample name”一栏中命名为“Std1”，“Std2”，“Std3”，“Std4”，“Std5”；将无模板对照NTC孔的“Task”一栏设置为“NTC”；将阴性质控NCS孔、待测样本TS孔、样本加标回收ERC孔的“Task”一栏设置为“Unknown”，并且在相应的“Sample Name”一栏中分别命名为“NCS”，“TS”，“ERC”；之后点击“Run Method”设置扩增程序（程序设置如4.所示），程序设置好后点击“Start Run”，开始仪器运行。
4. 扩增程序设置：设置反应体积30 μL。
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循环步骤 |
温度(℃) |
时间 |
循环数 |
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预变性 |
95℃ |
5 min |
1 |
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变性 |
95℃ |
15 sec |
40 |
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退火/延伸（收集荧光） |
60℃ |
30 sec |
七、qPCR结果分析
1.在“Analysis”的“Amplification Plot”面板中，系统会自动给出“Threshold”，有时系统给出的“Threshold”离基线太近，导致复孔之间Ct相差甚远，可手动调节“Threshold”至合适位置，点击“Analyze”。此时可在“Multicomponent Plot”初步查看扩增曲线的形态是否正常。
2. 在“Analysis”的“Standard Curve”面板中，可读取标准曲线的R²、扩增效率(Eff%)、斜率(Slope)、截距(Intercept)等。正常的标曲：R²>0.99，扩增效率在90%≤Eff%≤110%范围内，Slope在-3.6~-3.1。
3. 在“Analysis”的“View well table”面板中，“Quantity”一栏可读取无模板对照NTC、阴性质控NCS、待测样本TS、样本加标回收ERC的检测值，单位为copies/μL，后续可在检测报告中进行单位换算。
4. 结果分析的参数设置需依据具体的机型及使用的软件版本，一般也可由仪器自动判读。
5. 根据待测样本TS和样本加标回收ERC检测结果计算加标回收率，加标回收率要求在50%~150%之间。加标回收率计算公式：回收率(%) = {样本加标测定值(eg.copies/µL)-样本测定值(eg.copies/µL)} x洗脱体积(µL) / DNA加入量理论值(eg.copies) x 100%。
6. 阴性质控NCS的Ct值应大于标曲最低浓度Ct的均值。
7. 无模板对照NTC的检测结果应为Undetermined或Ct值≥35。
HB230217
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