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产品简介
GSTSep Glutathione Agarose Resin是一种GST标签蛋白纯化树脂，结构上以6%交联的琼脂糖凝胶为基质，通过12个原子的间隔臂，用化学方法共价结合还原型谷胱甘肽制作而成。该设计使树脂的纯化效率得到了较大提高，使其每毫升基质可承载>20 mg GST融合蛋白。
此外，本品特异性好，性价比高，可以一步纯化各种表达系统中谷胱甘肽-S-转移酶、谷胱甘肽依赖性蛋白和谷胱甘肽重组衍生物。
产品信息
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货号 |
20507ES10/20507ES50/20507ES60/20507ES80 |
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规格 |
10 mL /50 mL /100 mL/1000 mL |
产品性质
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基质（Matrix） |
6%交联的琼脂糖微球 |
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配体（Ligand） |
通过12原子间隔臂偶联的谷胱甘肽 |
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粒径（Bead size） |
45-165 µm |
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载量（Capacity） |
>20 mg GST蛋白（40 kDa）/mL基质 |
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最大压力（PressureMax） |
0.1 MPa，1 bar |
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pH稳定范围（pH range） |
3-12 |
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储存缓冲液（Buffer） |
含20%乙醇的1×PBS |
储存条件
2~8℃保存，有效期2年。
需准备试剂
所用水和Buffer在使用前最好用0.22 µm或0.45 µm滤膜过滤除菌。
平衡/洗杂缓冲液：140 mM NaCl，2.7 mM KCl，10 mM Na2HPO4，1.8 mM KH2PO4，pH 7.4
洗脱缓冲液：用平衡液配制10 mM 还原型谷胱甘肽（现配现用）
【注】平衡/洗杂缓冲液或洗脱缓冲液中可加入1-10 mM DTT。
使用说明
【注】样品在上样前最好用0.22 µm或0.45 µm滤膜过滤，减少杂质以防阻塞柱子。
- 样品准备
1）细菌表达的蛋白（本说明以细菌表达蛋白为例）
a. 挑取单菌落到含有适合抗性的LB培养基中，根据载体说明加入相应的诱导剂诱导相应的时间。
b. 表达结束后，将培养液转至离心瓶，7000 rpm，离心15 min，收集菌体，然后加入1/10体积的平衡液和PMSF（PMSF在破碎前加入，其终浓度为1 mM），同时也可加入其他蛋白酶抑制剂，但不能影响目的蛋白与树脂的结合。
c. 之后加入溶菌酶，使其工作浓度为1 mg/mL。【注】如果表达的宿主细胞内含pLysS或pLysE，可以不加入溶菌酶。
d. 将菌体沉淀悬浮起来（如果菌液浓度高，可考虑加入10 µg/mL RNase A和5 µg/mL DNase I），混匀，置于冰上超声破碎细胞，至菌液基本保持澄清。
e. 收集上述澄清蛋白液，10000 rpm，4℃离心20-30 min。取上清，0.22 µm/0.45 µm滤膜过滤后，置于冰上备用或-20℃保存。
2) 酵母、昆虫和哺乳细胞分泌表达的可溶性蛋白
将细胞培养液转移至离心瓶，5000 rpm离心10 min，收集上清。即可直接上柱纯化；【注】对于大量体积的上清，需加入硫酸铵进行沉淀浓缩，之后经平衡液透析后才能上柱。
- GSTSep Glutathione Agarose Resin重力柱的装填
- 取合适规格的重力层析柱（Cat#20520ES-20524ES），装入下垫片，加入适量纯水润洗柱管和垫片，关闭下出口。
- 将GSTSep Glutathione Agarose Resin混合均匀，用枪头吸取适量浆液加入重力柱中（填料实际体积占悬液的一半），打开下出口流干保护液。
- 加入适量纯水冲洗填料，待柱管中液体重力流干后，关闭下出口。
- 加入润洗后的上垫片，确保垫片与填料之间没有空隙，且保持水平。
- 装填好的重力柱可以直接加入平衡液进行平衡，暂不使用时则加入保护液，4℃保存。
- 样品纯化
- 孵育法纯化
- 根据纯化的样品量，取适量GSTSep Glutathione Agarose Resin加入离心管中，1000 rpm离心1 min, 吸弃上清；也可加入重力柱中，流干保护液。
b. 向离心管中加入5倍填料体积的平衡液清洗填料，1000 rpm离心1 min，吸弃上清；如使用重力柱，则直接在重力柱中清洗，直接重力流干平衡液；重复两次以上。
c. 加入样品，封闭离心管或重力柱管，4℃振荡孵育2~4 h或者37℃孵育30 min~2 h。
d. 孵育结束后，1000 rpm离心1 min，吸弃上清，或过滤收集填料，上清保留作为流穿，用于电泳鉴定。
e. 用5倍填料体积的洗杂液清洗填料，1000 rpm离心1min 或重力柱管过滤，去除上清（注意不要吸到填料），重复3-5次，中间建议更换新离心管。
f. 加入3-5倍柱体积的洗脱液进行洗脱，室温孵育5 min，1000 rpm离心1 min或重力柱管收集洗脱液，可重复2-3次。
2) 重力柱法纯化
a. 将装填好GSTSep Glutathione Agarose Resin的重力柱用5倍柱体积平衡液进行平衡，使填料处于与目的蛋白相同的缓冲液体系下，重复2-3次。
b. 将样品加到平衡好的重力柱中，样品保留时间至少2 min，保证样品和填料充分接触，收集流出液，可以反复上样增加结合效率。
c. 用10-15倍柱体积的洗杂液进行洗杂，去除非特异性吸附的杂蛋白，收集洗杂液。
d. 用5-10倍柱体积的洗脱液洗脱，分段收集，每一个柱体积收集一管，分别检测，既可以保证所有结合的目的蛋白被洗脱，又可以得到高纯度和高浓度的蛋白。
e. 随后依次用3倍柱体积的平衡液和5倍柱体积的去离子水清洗填料。5倍柱体积的20%乙醇平衡填料，最后将填料保存在20%乙醇的1×PBS中，置于4℃保存。
4. SDS-PAGE检测
将纯化过程中得到的样品（包括原始样品、流出组分、洗杂及洗脱组分等）利用SDS-PAGE进行检测，判定其纯化效果。
5. 填料清洗
GST标签蛋白纯化产品可以重复使用而无需再生，但随着非特异结合蛋白的增多和蛋白的聚集，会造成流速和结合载量性能下降，此时需对填料进行清洗。
1）去除一些沉淀或变形物质
用2倍柱体积的6 M盐酸胍溶液进行清洗，然后立即用5倍柱体积的PBS，pH 7.4清洗。
2）去除一些疏水性吸附造成的非特异性吸附物质
用3-4倍柱体积的70%乙醇或2倍柱体积1% Triton X-100清洗，然后立即用5倍柱体积的PBS，pH 7.4清洗。
注意事项
- 请勿冷冻保存本产品。
- GSTSep Glutathione Agarose Resin使用前一定要充分颠倒若干次，使琼脂糖珠混合均匀。
- 所有操作过程中，样本需要在4℃或冰上操作。
- 本产品仅作科研用途。
- 为了您的安全和健康，请穿实验服并佩戴一次性手套操作。
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