HEK293 Host Cell DNA Residue Detection Kit(3G) HEK293宿主细胞残留DNA检测试剂盒(3G)

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产品说明书

FAQ

COA

已发表文献

HEK293宿主细胞残留DNA检测试剂盒是用于定量分析检测各种生物制品的中间品、半成品和成品中残留HEK293宿主细胞DNA含量的试剂盒。

本试剂盒采用qPCR荧光探针原理,快速检测HEK293 DNA残留,其定量限可以达到10 fg/μL水平。该试剂盒可与本公司的磁珠法残留DNA样本前处理试剂盒(Cat#18461ES/18462ES)配套使用。

 

产品信息

货号

41331ES50/41331ES60

规格

50 T / 100 T

 

组分信息

组分编号

组分名称

41331ES50

41331ES60

41331-A

HEK293 qPCR Mix

0.75 mL

1.5 mL

41331-B

HEK293 Primer&Probe Mix

250 μL

500 μL

41331-C

DNA Dilution Buffer

1.8 mL×2管

1.8 mL×4

41331-D

HEK293 DNA Control (30 ng/μL)

25 μL

50 μL

 

运输和储存条件

1. 所有组分均干冰运输,-25~-15℃保存,有效期2年。其中A组分和B组分均需避光保存。

2. 收到货后,请检查共4个组分是否齐全,并立即放入对应的保存温度中储存。

 

注意事项

1. 本产品仅作科研用途。

2. 为了您的安全和健康,请穿实验服并佩戴一次性手套操作。

3. 使用本试剂前请仔细阅读本说明书,实验应规范操作,包括样本处理、反应体系的配制及加样。

4. 每个组分在使用前都应充分震荡混匀,低速离心。

 

适用机型

包含但不限于以下仪器:

Thermo Scientific:ABI 7500,ABI Quant Studio 5;

Bio-Rad:CFX96 Optic Module;

上海宏石医疗科技:SLAN-96S。

 

使用说明

1. HEK293 DNA Control定量参考品的稀释和标准曲线的制备

用试剂盒中提供的DNA Dilution Buffer(DNA稀释液)将HEK293 DNA Control定量参考品进行梯度稀释*,稀释浓度依次为3 ng/μL、300 pg/μL、30 pg/μL、3 pg/μL、300 fg/μL、30 fg/μL。

具体操作如下:

1)将试剂盒中HEK293 DNA Control和DNA Dilution Buffer置于室温融化,待完全融化后,轻微振荡混匀,低速离心10 sec。

2)取6支洁净的1.5 mL离心管,分别标记为Std0、Std1、Std2、Std3、Std4、Std5。

3)在标记为Std0的1.5 mL离心管中加90 μL DNA Dilution Buffer和10 μL HEK293 DNA Control,即稀释为3 ng/μL,振荡混匀后低速离心10 sec,该浓度可分装置于-25~-15℃短期保存(不超过6个月)**,使用时避免反复冻融。

4)在Std1、Std2、Std3、Std4、Std5离心管中先分别加入90 μL DNA Dilution Buffer***,再进行梯度稀释****,具体稀释方法如下:

稀释管

稀释比例

终浓度

Std1

10 μL Std0 + 90 μL DNA Dilution Buffer

300 pg/μL

Std2

10 μL Std1 + 90 μL DNA Dilution Buffer

30 pg/μL

Std3

10 μL Std2 + 90 μL DNA Dilution Buffer

3 pg/μL

Std4

10 μL Std3 + 90 μL DNA Dilution Buffer

300 fg/μL

Std5

10 μL Std4 + 90 μL DNA Dilution Buffer

30 fg/μL

1 标准品梯度稀释

*每个浓度做3个复孔,该试剂可测试300 pg/μL~30 fg/μL线性范围。若需要,可适当扩大或缩小线性范围。

**为减少反复冻融次数和避免污染,建议初次使用时将DNA定量参考品分装储存于-25~-15℃。

***已融化未使用的DNA稀释液可保存于2~8℃ 7天,若长时间不用,请放置于-25~-15℃。

****确保模板完全混匀,每个梯度稀释时需轻微震荡混匀约1 min。

2. 待测样本TS的制备

根据实验设置待测样本TS,具体操作如下:

100 μL待测样本加入1.5 mL洁净的离心管中,标记为TS,进行样本前处理,制备待测样本TS纯化液。

3. 待测样本回收质控ERC的制备

根据需要设置ERC中的HEK293 DNA标准品浓度(以制备加30 pg HEK293 DNAERC为例),具体操作如下:

1100 μL待测样本加入1.5 mL净的离心管中,再加入10 μL Std3,混匀标记为ERC

2回收ERC和同批待测样本一起进行样本前处理,制备加回收ERC纯化液。

4. 阴性抽提质控NCS的制备

根据实验设置阴性抽提质控NCS,具体操作如下:

1)取100 μL样本基质溶液(或DNA稀释液)加入1.5 mL洁净的离心管中,标记为NCS。

2)阴性质控NCS和同批待测样本一起进行样本前处理,制备成阴性质控NCS纯化液。

5. 无模板对照NTC的制备

根据实验设置无模板对照NTC,具体操作如下:

1)无模板对照NTC无需进行样本前处理,在qPCR法检测残留DNA含量阶段开始配置即可。

2)每管或孔中NTC样本为20 μL Mix混合液(即15 μL HEK293 qPCR Mix + 5μL HEK293 Primer&Probe Mix)+ 10 μL DNA Dilution Buffer,建议配置3个重复孔的量。

6. 反应体系

组分

体系(μL)

HEK293 qPCR Mix*

15

HEK293 Primer&Probe Mix

5

DNA Template**

10

总体系***

30

2 反应体系

*根据反应孔数计算本次所需的Mix混合液总量:Mix 混合液=(反应孔数+2)×(15+5) μL(含有2孔的损失量)。通常,每个样本做3个重复孔。

**反应孔数=(5个浓度梯度的标准曲线+1个无模板对照NTC+1个阴性抽提质控NCS+N个待测样TS)×3。

NTC (No Template Control):DNA Dilution Buffer

NCS (Negative Control Solution):样本基质溶液或DNA Dilution Buffer进行样本前处理后,所得纯化液为NCS

TS (Test Sample):待测样本

***加样完成密封好管子后,请低速离心10 sec将管壁的液体离心收集至管底,再震荡混匀5 sec以上,完全混匀反应液,再低速离心10 sec将管壁的液体离心收集至管底,如有气泡,需将气泡排尽。

为参考板位:

 

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

A

NTC

 

待测样本TS1

待测样本TS1

待测样本TS1

 

标准曲线Std1

标准曲线Std1

标准曲线Std1

 

 

 

B

NTC

 

待测样本TS2

待测样本TS2

待测样本TS2

 

标准曲线Std2

标准曲线Std2

标准曲线Std2

 

 

 

C

NTC

 

待测样本TS3

待测样本TS3

待测样本TS3

 

标准曲线Std3

标准曲线Std3

标准曲线Std3

 

 

 

D

 

 

 

 

 

 

标准曲线Std4

标准曲线Std4

标准曲线Std4

 

 

 

E

NCS

 

样本加标ERC1

样本加标ERC1

样本加标ERC1

 

标准曲线Std5

标准曲线Std5

标准曲线Std5

 

 

 

F

NCS

 

样本加标ERC2

样本加标ERC2

样本加标ERC2

 

 

 

 

 

 

 

G

NCS

 

样本加标ERC3

样本加标ERC3

样本加标ERC3

 

 

 

 

 

 

 

H

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

3 上机参考板位

该示例是对HEK293残留DNA qPCR法检测操作的展示,检测样本包括:5个浓度梯度的HEK293 DNA标准曲线、1个无模板对照NTC、1个阴性质控NCS、3个待测样本TS、3个加样回收ERC。建议每个样本做3个重复孔。

7. 扩增程序参数设置(以ABI公司7500 qPCR仪、软件版本2.0为例)

1)创建空白新程序,选择绝对定量检测模板。

2)创建一个检测探针,命名为“HEK293-DNA”,选择报告荧光基团为“FAM”,猝灭荧光基团为“None”;检测参比荧光为“ROX”(参比荧光可根据仪器型号等情况,选择是否需要添加)。

3)在“Assign target (s) to the selected wells”面板中,将标准曲线孔的“Task”一栏设置为“Standard”,并且在“Quantity”一栏分别赋值为“300000”、“30000”、“3000”、“300”、“30”(含义为每孔的DNA浓度,单位为fg/μL),并且在相应的“Sample Name”一栏中命名为“300 pg/μL”、“30 pg/μL”、“3 pg/μL”、“300 fg/μL”、“30 fg/μL”;将无模板对照NTC孔的“Task”一栏设置为“NTC”;将阴性质控NCS孔、待测样本TS孔、样本加标回收ERC孔的“Task”一栏设置为“Unknown”,并且在相应的“Sample Name”一栏中分别命名为“NCS”、“TS”、“ERC”,参比荧光勾选“ROX”,之后点击“Start Run”,开始仪器运行。

4)扩增程序设置:反应体积30 μL。

循环步骤

温度(℃)

时间

循环数

污染消化

37℃

5 min

1

预变性

95℃

5 min

1

变性

95℃

15 sec

45

退火/延申(收集荧光)

60℃

30 sec

4 扩增程序

 

8. qPCR结果分析

1“Analysis”的“Amplification Plot”面板中,系统会自动给出“Threshold”,有时系统给出的“Threshold”离基线太近,导致复孔之间Ct相差甚远,可手动调节“Threshold”至合适位置,点击“Analyze”。此时可在“Multicomponent Plot”初步查看扩增曲线的形态是否正常。

2“Analysis”的“Standard Curve”面板中,可读取标准曲线的R²、扩增效率(Eff%)、斜率(Slope)、截距(Intercept)等。正常的标曲:R²>0.99,扩增效率在90%≤Eff%≤110%范围内,Slope在-3.6~-3.1。

3“Analysis”的“View well table”面板中,“Quantity”一栏可读取无模板对照NTC、阴性质控NCS、待测样本TS、样本加标回收ERC的检测值,单位为fg/μL,后续可在检测报告中将单位换算成pg/μL或pg/mL。

4结果分析的参数设置需依据具体的机型及使用的软件版本,一般也可由仪器自动判读。

5根据待测样本TS和样本加标回收ERC的检测结果计算加标回收率,加标回收率要求在50%~150%之间。加标回收率计算公式:回收率(%) = {样本加标测定值(eg.pg/µL)-样本测定值(eg.pg/µL)}×洗脱体积(eg.µL) / DNA加入量理论值(eg.pg)×100%。

6阴性质控NCS的Ct值应大于标曲最低浓度Ct的均值。

7无模板对照NTC的检测结果应为Undetermined或Ct值≥32

 

Ver.CN20240110

 

400-6111-883