HEK293宿主细胞残留DNA检测试剂盒是用于定量分析检测各种生物制品的中间品、半成品和成品中残留HEK293宿主细胞DNA含量的试剂盒。
本试剂盒采用qPCR荧光探针原理,快速检测HEK293 DNA残留,其定量限可以达到10 fg/μL水平。该试剂盒可与本公司的磁珠法残留DNA样本前处理试剂盒(Cat#18461ES/18462ES)配套使用。
产品信息
货号 |
41331ES50/41331ES60 |
规格 |
50 T / 100 T |
组分信息
组分编号 |
组分名称 |
41331ES50 |
41331ES60 |
41331-A |
HEK293 qPCR Mix |
0.75 mL |
1.5 mL |
41331-B |
HEK293 Primer&Probe Mix |
250 μL |
500 μL |
41331-C |
DNA Dilution Buffer |
1.8 mL×2管 |
1.8 mL×4管 |
41331-D |
HEK293 DNA Control (30 ng/μL) |
25 μL |
50 μL |
运输和储存条件
1. 所有组分均干冰运输,-25~-15℃保存,有效期2年。其中A组分和B组分均需避光保存。
2. 收到货后,请检查共4个组分是否齐全,并立即放入对应的保存温度中储存。
注意事项
1. 本产品仅作科研用途。
2. 为了您的安全和健康,请穿实验服并佩戴一次性手套操作。
3. 使用本试剂前请仔细阅读本说明书,实验应规范操作,包括样本处理、反应体系的配制及加样。
4. 每个组分在使用前都应充分震荡混匀,低速离心。
适用机型
包含但不限于以下仪器:
Thermo Scientific:ABI 7500,ABI Quant Studio 5;
Bio-Rad:CFX96 Optic Module;
上海宏石医疗科技:SLAN-96S。
使用说明
1. HEK293 DNA Control定量参考品的稀释和标准曲线的制备
用试剂盒中提供的DNA Dilution Buffer(DNA稀释液)将HEK293 DNA Control定量参考品进行梯度稀释*,稀释浓度依次为3 ng/μL、300 pg/μL、30 pg/μL、3 pg/μL、300 fg/μL、30 fg/μL。
具体操作如下:
1)将试剂盒中HEK293 DNA Control和DNA Dilution Buffer置于室温融化,待完全融化后,轻微振荡混匀,低速离心10 sec。
2)取6支洁净的1.5 mL离心管,分别标记为Std0、Std1、Std2、Std3、Std4、Std5。
3)在标记为Std0的1.5 mL离心管中加90 μL DNA Dilution Buffer和10 μL HEK293 DNA Control,即稀释为3 ng/μL,振荡混匀后低速离心10 sec,该浓度可分装置于-25~-15℃短期保存(不超过6个月)**,使用时避免反复冻融。
4)在Std1、Std2、Std3、Std4、Std5离心管中先分别加入90 μL DNA Dilution Buffer***,再进行梯度稀释****,具体稀释方法如下:
稀释管 |
稀释比例 |
终浓度 |
Std1 |
10 μL Std0 + 90 μL DNA Dilution Buffer |
300 pg/μL |
Std2 |
10 μL Std1 + 90 μL DNA Dilution Buffer |
30 pg/μL |
Std3 |
10 μL Std2 + 90 μL DNA Dilution Buffer |
3 pg/μL |
Std4 |
10 μL Std3 + 90 μL DNA Dilution Buffer |
300 fg/μL |
Std5 |
10 μL Std4 + 90 μL DNA Dilution Buffer |
30 fg/μL |
表1 标准品梯度稀释
*每个浓度做3个复孔,该试剂可测试300 pg/μL~30 fg/μL线性范围。若需要,可适当扩大或缩小线性范围。
**为减少反复冻融次数和避免污染,建议初次使用时将DNA定量参考品分装储存于-25~-15℃。
***已融化未使用的DNA稀释液可保存于2~8℃ 7天,若长时间不用,请放置于-25~-15℃。
****为确保模板完全混匀,每个梯度稀释时需轻微震荡混匀约1 min。
2. 待测样本TS的制备
根据实验设置待测样本TS,具体操作如下:
取100 μL待测样本加入1.5 mL洁净的离心管中,标记为TS,进行样本前处理,制备待测样本TS纯化液。
3. 待测样本加标回收质控ERC的制备
根据需要设置ERC中的HEK293 DNA标准品浓度(以制备加30 pg HEK293 DNA量的ERC为例),具体操作如下:
1)取100 μL待测样本加入1.5 mL洁净的离心管中,再加入10 μL Std3,混匀,标记为ERC。
2)加标回收ERC和同批待测样本一起进行样本前处理,制备加标回收ERC纯化液。
4. 阴性抽提质控NCS的制备
根据实验设置阴性抽提质控NCS,具体操作如下:
1)取100 μL样本基质溶液(或DNA稀释液)加入1.5 mL洁净的离心管中,标记为NCS。
2)阴性质控NCS和同批待测样本一起进行样本前处理,制备成阴性质控NCS纯化液。
5. 无模板对照NTC的制备
根据实验设置无模板对照NTC,具体操作如下:
1)无模板对照NTC无需进行样本前处理,在qPCR法检测残留DNA含量阶段开始配置即可。
2)每管或孔中NTC样本为20 μL Mix混合液(即15 μL HEK293 qPCR Mix + 5μL HEK293 Primer&Probe Mix)+ 10 μL DNA Dilution Buffer,建议配置3个重复孔的量。
6. 反应体系
组分 |
体系(μL) |
HEK293 qPCR Mix* |
15 |
HEK293 Primer&Probe Mix |
5 |
DNA Template** |
10 |
总体系*** |
30 |
表2 反应体系
*根据反应孔数计算本次所需的Mix混合液总量:Mix 混合液=(反应孔数+2)×(15+5) μL(含有2孔的损失量)。通常,每个样本做3个重复孔。
**反应孔数=(5个浓度梯度的标准曲线+1个无模板对照NTC+1个阴性抽提质控NCS+N个待测样TS)×3。
NTC (No Template Control):DNA Dilution Buffer
NCS (Negative Control Solution):样本基质溶液或DNA Dilution Buffer进行样本前处理后,所得纯化液为NCS
TS (Test Sample):待测样本
***加样完成密封好管子后,请低速离心10 sec将管壁的液体离心收集至管底,再震荡混匀5 sec以上,完全混匀反应液,再低速离心10 sec将管壁的液体离心收集至管底,如有气泡,需将气泡排尽。
下表为参考板位:
|
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
6 |
7 |
8 |
9 |
10 |
11 |
12 |
A |
NTC |
|
待测样本TS1 |
待测样本TS1 |
待测样本TS1 |
|
标准曲线Std1 |
标准曲线Std1 |
标准曲线Std1 |
|
|
|
B |
NTC |
|
待测样本TS2 |
待测样本TS2 |
待测样本TS2 |
|
标准曲线Std2 |
标准曲线Std2 |
标准曲线Std2 |
|
|
|
C |
NTC |
|
待测样本TS3 |
待测样本TS3 |
待测样本TS3 |
|
标准曲线Std3 |
标准曲线Std3 |
标准曲线Std3 |
|
|
|
D |
|
|
|
|
|
|
标准曲线Std4 |
标准曲线Std4 |
标准曲线Std4 |
|
|
|
E |
NCS |
|
样本加标ERC1 |
样本加标ERC1 |
样本加标ERC1 |
|
标准曲线Std5 |
标准曲线Std5 |
标准曲线Std5 |
|
|
|
F |
NCS |
|
样本加标ERC2 |
样本加标ERC2 |
样本加标ERC2 |
|
|
|
|
|
|
|
G |
NCS |
|
样本加标ERC3 |
样本加标ERC3 |
样本加标ERC3 |
|
|
|
|
|
|
|
H |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
表3 上机参考板位
该示例是对HEK293残留DNA qPCR法检测操作的展示,检测样本均包括:5个浓度梯度的HEK293 DNA标准曲线、1个无模板对照NTC、1个阴性质控NCS、3个待测样本TS、3个加样回收ERC。建议每个样本做3个重复孔。
7. 扩增程序参数设置(以ABI公司7500 qPCR仪、软件版本2.0为例)
1)创建空白新程序,选择绝对定量检测模板。
2)创建一个检测探针,命名为“HEK293-DNA”,选择报告荧光基团为“FAM”,猝灭荧光基团为“None”;检测参比荧光为“ROX”(参比荧光可根据仪器型号等情况,选择是否需要添加)。
3)在“Assign target (s) to the selected wells”面板中,将标准曲线孔的“Task”一栏设置为“Standard”,并且在“Quantity”一栏分别赋值为“300000”、“30000”、“3000”、“300”、“30”(含义为每孔的DNA浓度,单位为fg/μL),并且在相应的“Sample Name”一栏中命名为“300 pg/μL”、“30 pg/μL”、“3 pg/μL”、“300 fg/μL”、“30 fg/μL”;将无模板对照NTC孔的“Task”一栏设置为“NTC”;将阴性质控NCS孔、待测样本TS孔、样本加标回收ERC孔的“Task”一栏设置为“Unknown”,并且在相应的“Sample Name”一栏中分别命名为“NCS”、“TS”、“ERC”,参比荧光勾选“ROX”,之后点击“Start Run”,开始仪器运行。
4)扩增程序设置:反应体积30 μL。
循环步骤 |
温度(℃) |
时间 |
循环数 |
污染消化 |
37℃ |
5 min |
1 |
预变性 |
95℃ |
5 min |
1 |
变性 |
95℃ |
15 sec |
45 |
退火/延申(收集荧光) |
60℃ |
30 sec |
表4 扩增程序
8. qPCR结果分析
1)在“Analysis”的“Amplification Plot”面板中,系统会自动给出“Threshold”,有时系统给出的“Threshold”离基线太近,导致复孔之间Ct相差甚远,可手动调节“Threshold”至合适位置,点击“Analyze”。此时可在“Multicomponent Plot”初步查看扩增曲线的形态是否正常。
2)在“Analysis”的“Standard Curve”面板中,可读取标准曲线的R²、扩增效率(Eff%)、斜率(Slope)、截距(Intercept)等。正常的标曲:R²>0.99,扩增效率在90%≤Eff%≤110%范围内,Slope在-3.6~-3.1。
3)在“Analysis”的“View well table”面板中,“Quantity”一栏可读取无模板对照NTC、阴性质控NCS、待测样本TS、样本加标回收ERC的检测值,单位为fg/μL,后续可在检测报告中将单位换算成pg/μL或pg/mL。
4)结果分析的参数设置需依据具体的机型及使用的软件版本,一般也可由仪器自动判读。
5)根据待测样本TS和样本加标回收ERC的检测结果计算加标回收率,加标回收率要求在50%~150%之间。加标回收率计算公式:回收率(%) = {样本加标测定值(eg.pg/µL)-样本测定值(eg.pg/µL)}×洗脱体积(eg.µL) / DNA加入量理论值(eg.pg)×100%。
6)阴性质控NCS的Ct值应大于标曲最低浓度Ct的均值。
7)无模板对照NTC的检测结果应为Undetermined或Ct值≥32。
Ver.CN20240110
推荐商品