E.coli宿主细胞RNA残留检测试剂盒是用于定量分析检测各种生物制品的中间品、半成品和成品中残留的E.coli总RNA含量的试剂盒。

本试剂盒采用探针法荧光定量PCR原理，可专一快速的检测E.coli细胞残留的总RNA，定量限低至1 fg/μL水平。该试剂盒可与本公司的磁珠法残留DNA样本前处理试剂盒(Cat#18461ES/18462ES)及Recombinant DNase I (RNase-free, Yeast) (Cat#14534ES50/14534ES60)配套使用。

 

组分信息

组分编号	组分名称	41318ES50	41318ES60
41318-A	E.coli qPCR Mix	0.75 mL	1.5 mL
41318-B	One Step Enzyme Mix	200 μL	400 μL
41318-C	RNA Dilution Buffer	1.8 mL×2管	1.8 mL×4管
41318-D	E.coli RNA Control（20 ng/μL）	25 μL	50 μL
41318-E	IC*	50 μL	100 μL

^*IC：Internal control，内部对照

 

运输和储存条件

1. 所有组分均干冰运输，-25~-15℃保存，有效期2年。其中，41318-A需避光保存。

2. 收到货后，请检查共5个组分是否齐全，并立即放入对应的保存温度中储存。

 

注意事项

1. 本产品仅作科研用途。

2. 为了您的安全和健康，请穿实验服并佩戴一次性手套操作。

3. 使用本试剂前请仔细阅读说明书，实验应规范操作，包括样本处理、反应体系的配制及加样。

4. 每个组分在使用前都应充分震荡混匀，低速离心。

 

适用机型

包含但不限于以下仪器：

Thermo Scientific：ABI 7500，ABI Quant Studio 5；

Bio-Rad：CFX96 Optic Module；

上海宏石医疗科技：SLAN-96S。

 

使用说明

1. E.coli RNA Control定量参考品的稀释和标准曲线的制备

用试剂盒中提供的RNA Dilution Buffer（RNA稀释液）将E.coli RNA Control定量参考品进行梯度稀释^*，稀释浓度依次为2 ng/μL、200 pg/μL、20 pg/μL、2 pg/μL、200 fg/μL、20 fg/μL、2 fg/μL。

具体操作如下：

1）将试剂盒中的E.coli RNA Control定量参考品和RNA Dilution Buffer置于冰上融化，待完全融化后，轻微振荡混匀，低速离心10 sec。

2）取7支洁净的1.5 mL离心管，分别标记为Std0、Std1、Std2、Std3、Std4、Std5、Std6。

3）在标记为Std0的1.5 mL离心管中加90 μL RNA Dilution Buffer和10 μL E.coli RNA Control定量参考品，Std0即稀释为2 ng/μL的浓度，振荡混匀后低速离心10 sec，该浓度可分装置于-25~-15℃短期保存（不超过3个月）^**，使用时避免反复冻融。

4）在Std1、Std2、Std3、Std4、Std5、Std6离心管中先分别加入90 μL RNA Dilution Buffer^***，再进行梯度稀释^****，具体稀释方法如下：

稀释管	稀释比例	终浓度
Std1	10 μL Std0 + 90 μL RNA Dilution Buffer	200 pg/μL
Std2	10 μL Std1 + 90 μL RNA Dilution Buffer	20 pg/μL
Std3	10 μL Std2 + 90 μL RNA Dilution Buffer	2 pg/μL
Std4	10 μL Std3 + 90 μL RNA Dilution Buffer	200 fg/μL
Std5	10 μL Std4 + 90 μL RNA Dilution Buffer	20 fg/μL
Std6	10 μL Std5 + 90 μL RNA Dilution Buffer	2 fg/μL

表1 标准品梯度稀释

^*每个浓度做3个复孔，该试剂可测试200 pg/μL~2 fg/μL线性范围。若需要，可适当扩大或缩小线性范围。

^**为减少反复冻融次数和避免污染，建议初次使用时将RNA定量参考品分装储存于-25~-15℃。

^***已融化未使用的RNA稀释液可保存于2-8℃ 7天，若长时间不用，请放置于-25~-15℃。

^****为确保模板完全混匀，每个梯度稀释时需轻微震荡混匀约15 sec。

2. 待测样本的前处理

1）样本中残留RNA的提取纯化可采用本公司的磁珠法残留DNA样本前处理试剂盒(Cat#18461ES/18462ES)。

2）待测样本在使用E.coli残留RNA试剂盒做qPCR检测前，需要进行DNase^*处理，以消除gDNA对qPCR检测的影响。

3）DNase用量和消化条件需按实际样品优化，可咨询翌圣生物获取相关建议。

^*本试剂盒不含DNase试剂，推荐您购买本公司的Recombinant DNase I (RNase-free, Yeast) (Cat#14534ES50/14534ES60)。14534ES50规格50U的酶量对应E.coli残留RNA检测试剂盒41318ES50的50T规格的用量，同理14534ES60规格100U的酶量对应41318ES60的100T规格的用量。

3. 样本加标回收质控ERC的制备

根据需要设置ERC中的E.coli RNA标准品浓度（以制备加20 pg E.coli RNA量的ERC为例^*），具体操作如下：

1）取100 μL待测样本加入1.5 mL洁净的离心管中，再加入10 μL Std3，混匀，标记为ERC。

2）加标回收ERC和同批待测样本一起进行样本前处理，制备加标回收ERC纯化液。

^*一般建议样本加标量设置在样本中宿主细胞RNA实际残留量的0.8~1.5倍，如果样品中RNA残留量低于定量限，加标量应设置到定量限之内，以保证检测结果可靠。

4. 阴性抽提质控NCS的制备

根据实验设置阴性抽提质控NCS，具体操作如下：

1）取100 μL样本基质溶液（或RNA稀释液）加入1.5 mL洁净的离心管中，标记为NCS。

2）阴性质控NCS和同批待测样本一起进行样本前处理，制备成阴性质控NCS纯化液。

5. 无模板对照NTC的制备

根据实验设置无模板对照NTC，具体操作如下：

1）无模板对照NTC无需进行样本前处理，在qPCR法检测残留RNA含量阶段开始配置即可。

2）每管或孔中NTC样本为20 μL Mix混合液（15 μL E.coli qPCR Mix + 4 μL One Step Enzyme Mix + 1 μL IC）+ 10 μL RNA Dilution Buffer，建议配置3个重复孔的量。

6. 反应体系

组分	体积(μL)
E.coli qPCR Mix*	15
One Step Enzyme Mix	4
IC	1
RNA Template**	10
总体积***	30

表2 标准品反应体系

^*根据反应孔数计算本次所需Mix混合液总量：Mix混合液=（反应孔数+2）× (15+4+1) μL（含有2孔的损失量）。通常，每个样本做3个重复孔。

^**反应孔数=（6个浓度梯度的标准曲线+1个无模板对照NTC+1个阴性抽提质控NCS+待测样TS个数+待测样本对应加标回收ERC个数）× 3。

NTC (No Template Control)：RNA Dilution Buffer

NCS (Negative Control Solution)：样本基质溶液或RNA Dilution Buffer进行样本前处理后，所得纯化液为NCS

TS (Test Sample)：待测样本

ERC (Extraction Recovery Control)：待测样本中加入如10 μL的2 pg/μL标准品RNA后进行样本前处理，所得纯化液为加标回收ERC

^***加样完成密封好管子后，请低速离心10 sec将管壁的液体离心收集至管底，再震荡混匀5 sec以上，完全混匀反应液，再低速离心10 sec将管壁的液体离心收集至管底，如有气泡，需将气泡排尽。

下表为参考板位：

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

A

NTC

待测样本TS1

待测样本TS1

待测样本TS1

标准曲线Std1

标准曲线Std1

标准曲线Std1

B

NTC

待测样本TS2

待测样本TS2

待测样本TS2

标准曲线Std2

标准曲线Std2

标准曲线Std2

C

NTC

待测样本TS3

待测样本TS3

待测样本TS3

标准曲线Std3

标准曲线Std3

标准曲线Std3

D

标准曲线Std4

标准曲线Std4

标准曲线Std4

E

NCS

样本加标ERC1

样本加标ERC1

样本加标ERC1

标准曲线Std5

标准曲线Std5

标准曲线Std5

F

NCS

样本加标ERC2

样本加标ERC2

样本加标ERC2

标准曲线Std6

标准曲线Std6

标准曲线Std6

G

NCS

样本加标ERC3

样本加标ERC3

样本加标ERC3

H

表3 上机参考板位

该示例是对E.coli残留RNA qPCR法检测操作的展示，检测样本包括：6个浓度梯度的E.coli RNA标准曲线、1个无模板对照NTC、1个阴性质控NCS、3个待测样本TS、3个加样回收ERC。建议每个样本做3个重复孔。

7. 扩增程序参数设置（两步法）（以ABI公司7500 qPCR仪、软件版本2.0为例）

1）创建空白新程序，选择绝对定量检测模板。

2）创建2个检测探针，Target 1命名为“E.coli-RNA”，选择报告荧光基团为“FAM”，猝灭荧光基团为“None”；

Target 2命名为“IC”，选择报告荧光基团为“VIC”，猝灭荧光基团为“None”。参比荧光为“ROX”（参比荧光可根据仪器型号等情况，选择是否需要添加）。

3）在“Assign target (s) to the selected wells”面板中，将标准曲线孔的“Task”一栏设置为“Standard”，并且在“Quantity”一栏分别赋值为“200000”、“20000”、“2000”、“200”、“20”、“2”（含义为每孔RNA浓度，单位为fg/μL），并且在相应的“Sample Name”一栏命名为“200 pg/μL”、“20 pg/μL”、“2 pg/μL”、“200 fg/μL”、“20 fg/μL”、“2 fg/μL”；将无模板对照NTC孔的“Task”一栏设置为“NTC”；将阴性质控NCS孔、待测样本TS孔、样本加标回收ERC孔的“Task”一栏设置为“Unknown”，并且在相应的“Sample Name”一栏中分别命名为“NCS”、“TS”、“ERC”，参比荧光勾选“ROX”，之后点击“Start Run”，开始仪器运行。

4）扩增程序设置：设置三步法扩增程序，反应体积30 μL。

循环步骤	温度（℃）	时间	循环数
逆转录	50℃	20 min	1
预变性	95℃	5 min	1
变性	95℃	15 sec	40
退火/延伸（收集荧光）	60℃	30 sec

表4 扩增程序

8. qPCR结果分析

1）在“Analysis”的“Amplification Plot”面板中，系统会自动给出“Threshold”，有时系统给出的“Threshold”离基线太近，导致复孔之间Ct相差甚远，可手动调节“Threshold”至合适位置，点击“Analyze”。此时可在“Multicomponent Plot”初步查看扩增曲线的形态是否正常。

2）在“Analysis”的“Standard Curve”面板中，可读取标准曲线的R²、扩增效率（Eff%）、斜率（Slope）、截距（Intercept）等。正常的标曲：R²＞0.99，扩增效率在90%≤Eff%≤110%范围内，Slope在-3.6~-3.1。

3）在“Analysis”的“View well table”面板中，“Quantity”一栏可读取无模板对照NTC、阴性质控NCS、待测样本TS、样本加标回收ERC的检测值，单位为fg/μL，后续可在检测报告中将单位换算成pg/μL或pg/mL。

4）结果分析的参数设置需依据具体的机型及使用的软件版本，一般也可由仪器自动判读。

5）根据待测样本TS和样本加标回收ERC的检测结果计算加标回收率，加标回收率要求在50%～150%之间。加标回收率计算公式：回收率(%) = {样本加标测定值(eg.pg/µL)-样本测定值(eg.pg/µL)}×洗脱体积(eg.µL) / RNA加入量理论值(eg.pg)×100%。

6）阴性质控NCS的Ct值应大于标曲最低浓度Ct的均值。

7）无模板对照NTC的检测结果应为Undetermined或Ct值≥32。

8）待测样本的Ct-IC值应该与NTC的Ct-IC值一致或±1，如果待测样本的Ct-IC值与NTC的Ct-IC值相比明显增大，则表明样本可能存在明显抑制。如果同时测试加标样本，则优先考虑样本加标回收率结果，IC结果作为参考。

Ver.CN20230830