蛋白纯化是将目标蛋白从实验样本总蛋白中分离出来，同时仍保留目的蛋白的生物学活性及化学完整性。

目的蛋白之所以能从混合物中分离出来也来源于蛋白独特的性质，这些性质是由于蛋白质的氨基酸的序列和数目不同造成的，利用待分离的蛋白质与其他蛋白质之间在性质的差异，即能设计出一组合理的分级分离步骤。可依据蛋白质不同性质与之相对应的方法将蛋白质混合物分离，

常用的方法有：凝胶过滤层析、离子交换层析、疏水层析、亲和层析等。其中亲和层析，是目前应用较多的纯化方法。

表1. 不同层析方法对比

“*”表示等级之分，数量越多表示性能越好。

亲和层析是应用生物高分子与配基可逆结合的原理，将配基通过共价键牢固结合于载体上而制得的层析系统。这种可逆结合的作用主要是靠生物高分子对它的配基的空间结构的识别。在亲和层析中起可逆结合的特异性物质称为配基。配基可以是酶的底物、抑制物、辅团因子、特异性的抗体等。

图1. 亲和层析纯化原理

亲和层析优点

（1）适合于从成分复杂且杂质含量远大于目标物的混合中提纯目标物；

（2）分离条件温和；

（3）结合效率高；

（4）分离速度快的优点。

翌圣琼脂糖凝亲和层析常见的产品有树脂填料以及预装柱形式，使用方法可借助重力法、手动加压法、蠕动泵法等。

图2. 琼脂糖凝胶亲和层析产品示例图

（1）树脂前期准备

A、填料量计算：根据树脂载量范围以及蛋白的总量来确定填料的填充量；比如his纯化树脂（＞40 mg 6×His-tagged protein/mL基质），表示1ml基质结合融合蛋白总量大于40 mg，40 mg为树脂的综合载量，此时在接近树脂结合载量时使用，可以获得最好蛋白分离效果。所以要求我们前期估算蛋白的总量，以此来确定树脂的使用量。

B、缓冲液：无菌水、 20% 乙醇、0.4 M NaCl 等溶液。

C、装柱策略选择
流动装填：设置一个固定的流速或压力，一步完成填料的沉降和压缩；

逐步装填：首先利用重力完成50%填料的沉降，然后将上层缓冲液移除，再次添加填料，逐步完成填料的填充，最终填料的体积需要多余柱体积的5%。

（2）重力柱使用流程

 图3. 重力柱装柱示意图

第一：准备重力柱；

第二：将白色小垫片塞入重力空柱中，垫片可用20%乙醇湿润；

第三：首先确认需要装入填料体积，移液枪将填料和缓冲液一起加入重力柱中；

第四：利用平衡液平衡填料，平衡后开始纯化样本。

（3）C型空柱手动装柱过程

图4. C型空柱装柱示意图

第一：准备C型柱空管，注意下方堵头不要去除；

第二：将白色小垫片塞入重力空柱中，垫片可用20%乙醇湿润；

第三：树脂与填料充分混匀，将混合液等体积装入柱子中，等树脂沉淀之后，用移液枪移除上层缓冲液；

第四：此时切勿将树脂暴漏在空气中太久，赶紧进行第五步；

第五：再次添加剩余柱体积的树脂与缓冲液混合物，等树脂沉淀后移除上层缓冲液。反复添加，保证最终树脂的添加总量要超出柱体积的5%左右，以确保后期安装完成的柱子中无空气；

第六：先安装上垫片，再把黑色分配器装进去（分配器有接口的那边朝上），盖上红色的盖子；

第七；拧上上堵头，装柱完成，使用时将下堵头去掉即可。

预装柱的使用可借助多种方法实现蛋白样本的纯化，客户可针对自己的实验需求以及实验室所具备实验耗材选择相应的方法：

图5. 预装柱使用方法示例图

表2. 预装柱不同纯化方法的比较

Q1、目的蛋白大量表达时需要注意什么？

A：载体构建是否合适——检查启动子、读码框、终止子等。某些基因含有许多稀有密码子，尤其是起始密码子后15 个碱基内的，会显著影响蛋白的表达;

表达系统是否恰当——常见的有四大表达系统，即大肠杆菌、酵母细胞、昆虫细胞以及哺乳细胞表达系统。不同的表达系统适合表达不同的蛋白，这个要根据情况选择;

标签选择是否合适——GST、SUMO 等标签具有提高融合蛋白可溶性的能力。

Q2、C型柱树脂填料装柱时对称性不好，如何解决？

Q3、不同的装柱缓冲液会影响填料的哪些参数？

A：在不同的装柱缓冲液中，填料的压缩因子也会不同。通常填料在水和20％ 乙醇中均可快速沉降。添加一定的盐会减慢填料沉降的速度，但同时也可以帮助填料不会压得过于紧实。

Q4、填料是否可以重复使用？可以使用多少次?

A：如果维护的好的话，填料在其效期之内可以一直重复使用。举例：his纯化树脂：如果每次都是纯化同样的蛋白就没有必要剥离掉镍离子重新挂镍，一般经过5-7次纯化之后可以进行脱镍和再生镍的操作。如果柱子反压高了，填料需要做彻底的在位清洗CIP，在清洗之前，为了避免金属盐的沉淀，需要剥离掉镍离子，然后再重新挂镍，清洗后保存在20％的乙醇中。填料的寿命因使用的环境，纯化的样品的特性，保存方式等都有直接关系。

Q5、如何确定装柱成功？

A：层析柱调水平；层析柱上下筛网无气泡；胶悬液浓度控制在50%-60% ；了解填料装柱因子和关键装柱参数；

Q6、预装柱常见问题有哪些？