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攻无不“克”的无缝克隆为何备受青睐?

导读

 
在经历了多次PCR、酶切、连接、转化后,有些小伙伴仍会面临克隆阳性率低的情况,每一步都认真地完成,但仍然存在不少的问题。今天小翌给大家介绍一下近年来备受科学家们青睐的“无缝克隆”。相比于传统的酶切克隆,无缝克隆更快更灵活,不受酶切位点限制,可以在质粒的任何位点进行一个或多个DNA片段的插入。
 

传统酶切克隆

1. 受限制性内切酶的限制
2. 连接效率低:T4 DNA连接酶连接效率具有序列的偏好性
3. 耗时长:酶连过夜
4. 多片段克隆困难
 
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图1.传统酶切克隆
 

无缝克隆

1. 无需考虑酶切位点,适用任意载体、任意片段
2. 阳性率高,可用于50 bp -10 kb的片段
3. 连接快速,20-30 min即可完成
4. 可用于多片段克隆、基因突变、多顺反子表达载体构建
 
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图2.无缝克隆
 
 
无缝克隆的原理
 
与传统的双酶切克隆一般,无缝克隆依赖于dsDNA的黏性末端进行互补配对,但无缝克隆并不使用内切酶来制造黏性末端,而是通过T5核酸外切酶来产生的。T5核酸外切酶能够沿着5’→3’方向,降解dsDNA,从而产生黏性末端,但是,T5外切酶并不能保证每一个片段5’端都会酶切成一样长的粘性末端。因此退火之后,无缝克隆中的DNA聚合酶会针对缺失的碱基进行添加,Taq连接酶催化碱基之间形成磷酸二酯键,将所有缺口补齐。
 
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图3.无缝克隆原理图
 
 
无缝克隆优势详解
 

1. 不受片段、载体序列的限制,可任意组装

 
传统的酶切克隆:克隆载体的多克隆位点需携带可用的单一酶切位点,同时酶切位点若存在于外源片段也会极大程度限制克隆。此外,还需要购买各式各样不同的内切酶。
 
无缝克隆:仅靠同源臂进行互补配对。
 

2. 可同时无缝地拼接多个片段

 
传统的酶切克隆:由于酶切位点的限制和酶切位点之间存在着一定的距离和交叉覆盖,可组装的片段有限,酶切克隆通常需要分多次拼接,一般只能拼接2-3个片段,耗时耗力。
 
无缝克隆:可同时拼接4-6个片段,并且只需要将所有片段混在一个试剂管中反应即可。
 

3. 操作简便,时间上大大节省

 
传统的酶切克隆:传统的片段和载体酶切均需要2-4小时,此外还需要对相关产物进行末端补平、磷酸化、产物纯化等一系列操作。为保证连接成功,还需在16℃条件下过夜连接。
 
无缝克隆:仅需PCR和胶回收,连接体系反应时间为20min左右,连接单个和多个片段的时间一致。相比于传统酶切克隆,可节约1天左右的时间。
 
 
无缝克隆操作步骤
 
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图4.无缝克隆关键步骤
 

1. 线性化载体制备

 
① 线性化方式:酶切或者PCR;
② 产物纯化:胶回收/PCR产物纯化;
 

2. PCR获取目的插入片段

 
5’引物需要和线性化载体末端15-25 bp的序列重叠。
 
小翌推荐使用引物设计工具:https://www.yeasen.com/hieff-clone/
 

3. 重组反应

按一定比例将线性化载体与插入片段进行混合,50℃反应20 min后即可用于转化。
 
分子克隆发展至今,翌圣利用同源同组的原理,匠心研发了多款一步法快速克隆产品。自产品上市以来,受到了诸多客户的支持,备受好评。以下是部分产品的性能展示:
 
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图5. Hieff Clone® One Step Cloning Kit(CAS#10911)试剂盒可以有效克隆不同长度的单片段基因。载体:4.7 kb。插入片段:1.2 kb,3 kb和5 kb。
 
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图6.Hieff Clone® Plus Multi One Step Cloning Kit(CAS#10912)试剂盒进行3个片段克隆。载体:10 kb。插入片段:1 kb,1.5 kb和2.5 kb。
 
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图7.Hieff Clone® Universal One Step Cloning Kit(CAS#10922)试剂盒进行5个片段克隆(上)、6个片段克隆(下)。载体:5 kb。插入片段:4kb(上)和5 kb(下)。
 
 
产品已发表文献
 

1. Jiang, Y., et al., Plants transfer lipids to sustain colonization by mutualistic mycorrhizal and parasitic fungi[J]. Science, 2017. (IF 37.205)
 

2. Liu C X, Li X, Nan F, et al. Structure and degradation of circular RNAs regulate PKR activation in innate immunity[J]. Cell, 2019. (IF 31.398)

 

3. Xing, Y.H., et al., SLERT Regulates DDX21 Rings Associated with Pol I Transcription[J]. Cell, 2017. 169(4): p. 664-678.e16. (IF 31.398)
 

4. Wang Y, Hu SB, et al. Genome-wide screening of NEAT1 regulators reveals cross-regulation between paraspeckles and mitochondria[J]. Nat Cell Biol. 2018 Oct;20(10):1145-1158. (IF 20.46)
 

5. Li X., et al., Coordinated circRNA Biogenesis and Function with NF90/NF110 in Viral Infection[J]. Mol Cell. 2017 Jul 20;67(2):214-227.e7. (IF 14.548)
 

6. Yao R W, Xu G, Wang Y, et al. Nascent Pre-rRNA Sorting via Phase Separation Drives the Assembly of Dense Fibrillar Components in the Human Nucleolus[J]. Molecular cell, 2019. (IF 14.548)

 

7. Wu P, Zhang T, Liu B, et al. Mechano-regulation of peptide-MHC class I conformations determines TCR antigen recognition[J]. Molecular cell, 2019, 73(5): 1015-1027. e7. (IF 14.548)
 

8. Qiao HH, Wang F, et al. An efficient and multiple target transgenic RNAi technique with low toxicity in Drosophila[J]. Nat Commun. 2018 Oct 8;9(1):4160. (IF 12.353)

 

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分类
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